一条DNA引物序列合成方案设计.docVIP

PAGE 7 一条DNA引物序列合成方案设计 一、设计背景 合成寡核苷酸有着广泛的应用，包括用作杂交探针、DNA和RNA序列测定的引物、cDNA和基因组DNA克隆的分离、定点突变、合成DNA和RNA结构的晶体学和生物物理学研究，以及反义和反基因药物的潜在治疗。 寡核苷酸常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中；寡核苷酸合成的DNA（脱氧核糖核酸）可以用于链聚合反应，能放大确定几乎所有DNA的片段，在这个过程中寡核苷酸是作为引物，和DNA中标记的互补片段结合，作成DNA的复制品；调控寡核苷酸用于抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白，在制止癌细胞活动方面能起一定的作用。 寡核苷酸的合成是一种重复的技术，在固体载体上的合成优于溶液或聚缩合成方法。固相亚磷酰胺三酯法是目前最常用的Oligo DNA化学合成方法，它具有高效，快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。固相亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3’到5’磷酸二酯键连接。 二、设计依据 脱氧核糖核酸（英文DeoxyriboNucleic Acid，缩写为DNA）是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。 DNA 分子结构中，两条多脱氧核苷酸链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成双螺旋结构。脱氧核糖-磷酸链在螺旋结构的外面，碱基朝向里面。两条多脱氧核苷酸链反向互补，通过碱基间的氢键形成的碱基配对相连，形成相当稳定的组合。 三、设计方案 （一）实验前准备 1.试剂与仪器 （1）试剂 试剂盒dA、dC、dG、dT CPG deoxy Adenosine (n-bz) CED phosphoramidite（dA单体） deoxy Cytidine (n-acetyl) CED phosphoramidite（dC单体） deoxy Guanosine (n,n-dmf) CED phosphoramidite（dG单体） Thymidine CED phosphoramidite（dT单体） 辅助试剂：TCA-Deblock、ETT Activator、Oxdizing(0.05M)、CAP A、CAP B Wash A、Wash B（乙腈）。 图1 DNA引物序列合成常用试剂 （2）仪器 METTLER TOLEDO Gmbh天平、温湿度计、手套箱、1000ul移液枪、1000ul移液枪头、HM-2N桌上振荡器、KA合成仪。 图2 天平 图3 手套箱 图4 KA合成仪 2.试药配制 （1）CPG的分装制备 根据需合成DNA序列，准备好所需的空柱、柱塞、CPG、天平，并确认其批号，在空柱一端将柱塞平整推入至1/4处，确认分装量并称量，称量无误后，将柱管装有柱塞的一端置下并将CPG导入空柱中，注意避免将CPG散落到柱口或柱外，将柱管的另一端用柱塞平整推入至1/4处，贴上标签。 （2）所需Amidite（单体）的制备 ①准备：将封口膜、溶解乙腈、干净干燥的试剂瓶、Amidite、量筒、电子温湿度计放入手套箱中。启动手套箱，手套箱内湿度低于30%方可操作。 ②称量：在手套箱中称量Amidite，称量完毕后将Amidite导入试剂瓶中。 ③量取：量取适量溶解乙腈并小心快速注入试剂瓶中，充入氩气，加入干燥剂，拧紧瓶盖，将试剂瓶用封口膜密封，摇晃至固体粉末完全溶解。 ④保存：溶解的Amidite放入电子防潮柜中分类保存。 Amidite溶解体积如下表： 表1 Amidite溶解体积表 Amidite 包装 体积（ml） 0.1M 高通量 A 5g/PC 60 100 120 G 5g/PC 60 100 120 C 5g/PC 60 100 120 T 5g/PC 65 110 135 rA 1g/PC 10 - - rG 1g/PC 10 - - rC 1g/PC 11 - - rU 1g/PC 12 - - （二）合成原理及合成操作步骤 1.合成原理 （1）脱保护:将预先连接在固相载体CPG.上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸（二氯乙酸）反应，脱去其5-羟基的保护基团DMT，获得游离的5-羟基。 （2）偶联:合成DNA的原料-单体,与活化剂（ETT）四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5 -羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5 -羟基发生缩合反应。 （3）盖帽(ca