分子诊断技术检测感染性疾病的应用和发展.docxVIP

分子诊断技术检测感染性疾病的应用和发展 以分子生物学为核心的实验诊断技术是当前感染性疾病临床实验诊断的重要手段，高效、快速地检测病原微生物对于感染性疾病的临床诊疗意义重大。而随着近年来纳米材料、应用化学、光物理学和生物传感等技术的进步，分子诊断技术也迎来了革命性的创新和发展。分子诊断技术具有特异性强、灵敏度高、周转时间短和应用范围广等众多优点，在感染性疾病的临床诊断中已应用十分广泛。 一、新一代定量PCR技术 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是1985年建立的在体外特异性扩增一段特定核酸序列的技术，是目前病原微生物分子生物学检测中应用最为广泛的技术。第1代普通PCR 技术，只能定性而不能准确定量，并且操作过程需要开盖，易造成“气溶胶”污染。研究者们在常规PCR技术的基础上，于1996年建立了实时PCR技术或荧光定量PCR，实现对PCR过程中产物量的实时监测，无开盖操作，污染风险低，能准确定量检测。目前在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、结核分枝杆菌等感染性疾病中细菌、病毒的定量监测中广泛应用。但对于较低拷贝数的DNA难以检测，而且扩增效率的差异会直接导致实验室内或者不同实验室检测结果的偏差。 而数字PCR（digital PCR，dPCR）技术是基于传统PCR以及实时定量PCR发展起来的第3代PCR技术，能更准确地观察到单拷贝核酸分子的动态，可让研究人员能够直接数出单基因分子的个数，对起始样品进行绝对定量。已有研究表明，dPCR 能够检测出极低拷贝的靶标分子，灵敏度高于目前常用的实时定量PCR，并且 dPCR 不需要制备标准曲线、不受基因扩增效率的影响，在临床诊断领域具有独特的优势。由于 dPCR 的高灵敏度，临床微生物标本无需培养即可以进行检测，大大缩短临床报告时间，并且可以准确地检测细菌数目和病毒载量，从而对疾病进行早期诊断、药物疗效观察、病情判断及预后观察，目前 dPCR 技术已广泛应用于HBV、HIV、甲型流感病毒等临床领域。在临床中HBV共价闭合环状DNA被认为是根除HBV的关键，有研究表明，与传统的FQ-PCR相比，dPCR至少可检测102个以上的HBV共价闭合环状DNA，相当于0.540~0.594个拷贝的共价闭合环状DNA用于精确检测HBV感染。未来dPCR可以进一步提高检测通量，进行多通道检测，同时对多个靶标多个标本检测；同时提高检测自动化程度，实现全自动化检测流程，提高检测速度，进一步降低检测时间，降低检测成本等。随着dPCR为代表的新一代定量PCR技术的发展，在针对感染性疾病的临床实验诊断将迈向新的台阶。dPCR临床检测应用尚暂无国家或行业统一标准，且缺乏商品化的室内质控品，因此需要建立适宜的室内质控措施，建立规范化的标准检测分析流程。 二、等温扩增技术 由于PCR技术对精密昂贵的热循环仪的严重依赖，很大程度上限制了其在经济和医疗资源有限的地区、医院以及在现场快速检测（point-of-care testing，POCT）平台开发方面的应用。目前，等温扩增技术近年来发展迅速，因不需要热循环仪支持，可以在更短的时间内以恒定温度实现目标基因快速高效扩增的特点，使其成为核酸扩增领域一种极有前途的替代方法。常见的等温扩增技术有：环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增技术、滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）、核酸序列依赖扩增技术（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）和链置换扩增技术等。 LAMP技术因具有特异性高和操作简便等特点，已成为应用最广泛的核酸等温扩增技术。其可以在60~65 ℃的恒定温度下实现对目标序列6个区域的快速特异性扩增，反应时长为30~60 min[8,?9]；特异性和灵敏度高，扩增时间相对较短，扩增效率极高，对扩增条件的耐受性相对较高，扩增结果可通过肉眼、荧光、电泳、电化学传感器、横向流动试纸条等多种方法进行判读，非常适用于病原体的POCT检测。但由于引物设计繁琐，扩增晚期易出现非特异性扩增。Mashooq等利用实时LAMP技术在20 min内实现了对沙门菌的快速便捷检测，灵敏度达10基因组拷贝/反应，比基于TaqMan荧光探针的qPCR高10倍。值得注意的是，由于LAMP的高灵敏度和高产率等特点，LAMP容易产生气溶胶污染，因此如何集样本前处理、核酸等温扩增和结果判读于一体也是LAMP广泛应用于病原体POCT的难点之一。 重组酶聚合酶扩增技术是另一项应