类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用（心脑血管资料）.docVIP

类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用（心脑血管资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用 1 1资料与方法 2 文2：细丝蛋白A在结直肠腺癌中的表达及临床意义 5 1 材料与方法 6 2 结果 7 3 讨论 7 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用（心脑血管资料） 文1：类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用 肝癌因其存活率低，发病率高，已成为众多学者关注的对象[1-3]。类泛素是与泛素具有相似功能的蛋白，在结构上与泛素具有部分相同序列。FAT10是一种新发现的，可以通过共价结合发挥泛素样作用的类泛素蛋白[4-6]。其在多种癌细胞如胃肠癌、肝癌等细胞中得以表达[7-10]。因此，本实验先对肝癌及癌旁组织的FAT10进行检测，后将FAT10 siRNA和重组表达载体转染肝癌细胞，采用多种方法分别检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化，旨在为肝癌的治疗提供新的手段。 1资料与方法 一般资料 设计：随机对照动物实验。 时间及地点：2014年9月～2015年12月在沈阳医学院实验室完成。 材料及来源：SMMC-7721细胞株购于上海誉贸实业有限公司，由本实验室保存。L-DMEM培养基、胎牛血清和混合抗生素购自GIBCO公司，FAT10 siRNA和重组表达载体均由上海吉玛公司合成，电穿孔仪，TRIzol Reagent购自Invitrogen公司，CCK-8试剂盒购于上海Dojind化学科技有限公司，流式细胞仪购于赛默飞公司，多克隆兔抗体Akt购于Proteintech公司，GAPDH抗体购于Bioworld公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自优维宁生物技术公司。 RT-PCR检测FAT10表达 38例肝癌大鼠开腹，取少量肝癌及癌旁组织粉碎后，加入含1 mg/ml亚铁离子的PBS多次反复冲洗，用匀浆器打匀，并过100 mm滤膜，备用。吸取2 μl的悬浮细胞液，正反向引物各加入1 μl悬浮细胞液。反应循环条件如下：95℃变性5 min，95℃退火30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，45循环，最终72℃延伸7 min。将PCR产物10 μl于%琼脂糖凝胶电泳30 min，采用凝胶自动成像及分析系统，电泳结果用凝胶图像分析系统分析电泳条带光密度值，计算光密度与GAPDH的光比值。 流式细胞术检测细胞周期和凋亡 未经任何处理的肝癌细胞为空白组。转染FAT10 siRNA（FAT10 siRNA组）和重组表达载体（组）48 h后，收集各组细胞，37℃下，%胰酶消化，1500 min，离心10 min，去上清，PBS洗涤3次，重悬细胞浓度为1×106/ml。移液枪取100 μl的细胞于流式管中，缓慢加入70%的乙醇溶液，同时用移液枪移取100 μl的细胞于另一组流式管中，缓慢加AnnexinV-FITC溶液，两组流式管4℃下充分振荡，并静置24 h，1000 min离心10 min后，除去细胞固定液，PBS溶液洗涤多次，加入100 μl，200 μg/ml的RNA酶溶液，室温静置1 h，加入50 μg/ml的PI液染色， h后流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。 RT-PCR检测PI3K/Akt信号通路 按TRIzol Reagent说明书提取各组细胞总RNA，以总RNA mRNA为模板，反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。正反向引物各加入1 μl悬浮细胞液FAT10的上游为：5′-AATACCTGGTGTCGGTCTCA-3′，下游为：5′-TCGAGCTCATCCTAATGGAG-3′，扩增目的基因片段长度为210 bp。内参GAPDH的上游为：5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′，下游为：5′-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3′，目的基因扩增长度为350 bp。反应条件：95℃变性5 min，95℃退火30 s，℃ 30 s，72℃ 30 s，30循环，72℃延伸10 min。将PCR产物10 μl于%琼脂糖凝胶电泳30 min，结果用凝胶图像分析系统分析，计算光密度与GAPDH的光比值。 统计学方法 采用SPSS 统计软件对数据进行分析，计量数据以平均数±标准差表示，采用t检验，多组间的数据比较采用方差分析，以P为差异有统计学意义。 2结果 FAT10在肝癌及癌旁组织中的表达 肝癌组织中FAT10的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P）（图1） 细胞周期及凋亡 沉默FAT10表达，FAT10 siRNA组细胞