食品生物技术精品课程.pptVIP

5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区： RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点 转译起始密码子AUG 或GUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列 三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。 2、基因剂量： 3、核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。 AUG—SD间距离。 AUG后的核苷酸 五．原核表达载体：? 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。 主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因 类型： 融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 （一）融合型表达载体 P SD Foreign DNA 融合型表达载体 融合基因 技术关键：克隆基因插入原核序列3’端而维持正确阅读框架。 选择合适酶切位点 加入人工合成的DNA接头 构建位相载体 优点： 表达效率高 产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 易纯化：利用融合原核多肽的特性 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子 位相载体 融合型载体----pGEX系列 （二）非融合型表达载体 P SD Foreign DNA 非融合型表达载体 非融合基因 主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子 非融合型表达载体----pPL-Lamda PL启动子---温度诱导 插入位点--HpaI （三）分泌型表达载体： 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 分泌型表达载体----pINIII-ompA1 分泌型融合表达载体----pEZZ18 六．提高表达水平的手段 1、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子----提高转录水平 核糖体结合位点（ATG---SD） 避免产物降解 ：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂 2、选择合适宿主 Lac 启动子----LacI菌 PL/PR -------- CI857 溶源菌 3、诱导表达 温度诱导------PLPR / IPTG的化学诱导----Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解 食品生物技术精品课程 主讲：刘常金 第三章 蛋白质改造的分子途径及其蛋白质的异源表达 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点，可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。 位点特异性突变又可大体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)，以双链DNA为模板进行的基因突变。 PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一