荧光标记复合扩增讲解实用.docVIP

荧光标志复合扩增试剂盒归纳 一、荧光标志复合扩增检测技术简介 DNA分析近十几年来才应用于法医学的判断， 在这时期，DNA 分型技术获得了两次重 大打破。1985年，Jeffereys等学者成立了第一代分型技术—— DNA 指纹技术，其实质是以 DNA分子杂交为核心的限制性片段长度多态性分析，实现了人证判断由除掉到认定的飞驰 口]。进入20世纪90年代，Mullis和Saiki等学者发明并改进的 PCR技术被用于法医 DNA 分析，从而成立了以PCR为基础的第二代 DNA分型技术。其实质是应用 PCR技术扩增人 类基因组DNA中高度多态性位点，扩增产物经过片段长度多态性分析或序列多态性分析研 究不一样个体间DNA分子水平上的差异及其遗传规律。此技术一经出现，便在个体鉴识亲子 判断中发挥了重要作用。经过近十多年的发展，法医 DNA分析已成立了DNA指纹技术， PCR扩增片段长度多态性分析技术和线粒体 DNA测序等三大主要技术， 结合在它们基础上 发展出的一些新技术方法， 如小卫星重复单位多态性分析 (PCR—MVR)、单链构象多态性分 析(PCR—SSCP)、等位基因特异性引物PCR扩增(PCR—SSP)等，共同形成了当前的法医 DNA 分析技术。 在一个PCR系统中同时扩增加个基因座的方法叫做复合扩增 (multiplexingPCR)。单个 基因座等位基因数目少， 信息量有限，假如多个基因座扩增条件基实情似， 就可以将多个基 因座的引物加入一个扩增管中进行复合扩增， 一次电泳检测，可在短时间内获取多个基因座 的分型结果，提高单次检测的信息量，提高个人鉴识率， 也可降低成本和检材的耗费， 减少 操作强度，对微量检材的判断特别有价值，有益于复核判断。 STR荧光标志检测技术是指将荧光染料标志到此中一个引物 (一般选正链)的5端,使随 后的每一个PCR扩增产物都带有一个荧光染料分子。这类带有荧光分子的 DNA片段在电 泳时从阴极朝阳极电泳迁徙 ,迁徙速度按片段分子量由小到大摆列 ,当片段经过到阳极端的激 光扫描窗口时,荧光染料分子的共辄双键遇到激发 ,发出必定波长的荧光 ,被扫描仪CCD接收, 每一个带荧光染料的DNA片段按各自经过激光扫描窗口的实质时间 (realtime)被记录下 来,出现一个荧光汲取峰,以荧光峰来表示每一个片段 ,峰值高低与扩增片段数目呈正相关 ,而 峰出现的时间与片段大小呈正相关 ,片段小,出现峰时间短。依据同一泳道内标准分子量 (简称 为内标)的迁徙率获取每一泳道迁徙率的标准曲线 ,计算出待测样品的分子量大小 ,应用ABI 3130XL型基因分析仪片段分析精确度可达 0.5bp。利用片段分析软件将测定的样品片段大 小与同-一批加样的等位基因标准物 (ladder)的片段大小比对,进行基因型命名(图1 为荧光标 记复合扩增检测技术原理 )。所以,这类复合检测系统可以同步检测多个 STR基因座,该检测 系统可以依据等位基因片段所带的劳光颜色不一样加以差异 ,即使等位基因片段长度有重叠的 基因座,也可采纳不一样的荧光标志 ,区分不一样基因座的等位基因。 当前STR检验主要应用多色 荧光标志复合扩增毛细管电泳自动检测技术。 图1荧光标志复合扩增检测技术原理 应用基于荧光标志复合扩增结合毛细管自动电泳技术而幵发的各种商业化试剂盒,是目 前法医STR检验的主要技术手段。当前，国内外用于生物检材个体鉴识检验、亲子判断和 成立DNA数据库的商品化STR复合试剂盒主要有：IdentifilerTM、SINOfiler（美国ABI公 司）、PowerplexTM16（美国Promega公司）、DNATyperTM15plus（公安部人证判断中心）、 Goldeneye16A（北京基点认知技术有限公司）、AGCU（无锡中德美联生物技术有限公司）。 它们最多可获取18个常染色体STR基因座的分型结果。 二、法医DNA判断常用试剂盒 1、AppliedBiosystems  公司（美国）：  IdentifilerPCR  扩增试剂盒 英文名称：  AmpF/STR?Identifiler?PCRAmplificationKit 产品归纳 基因座和  AmpFSTRIdentifilerPCR扩增试剂盒可以在单次PCR反应中同时扩增15个STR Amelogenin性别基因。Identifiler试剂盒中进行复合扩增的四核苷酸位点包含 CODIS所必需的13个核心STR位点，即CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、和vWA。获取的数据可以满足ENFSI（欧洲法医学网）与Interpol（国际刑警组