RNA干扰作用原理及其应用.docx

RNA干扰作用原理及其应用 【摘要】 RNA干扰是基因转录后缄默一个方式，是生物界古老而且进化高度保守现象之一。RNAi是经过siRNA介导特异性高效抑制基因表示路径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具备生物催化反应特征，反应中需要多个蛋白因子以及ATP参加。RNAi在基因功效研究和基因药品应用具备广泛前景。  【关键词】 RNA干扰 siRNA dsRNA RNA诱导缄默复合体 Argonaute RNA聚合酶III开启子   【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient　is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-stranded RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug.   【Key words】 RNA interference(RNAi) small interfering RNA(siRNA) double-stranded RNA(dsRNA) RNA-induced silencing complex(RISC) Argonaute pol III   1 背景   20 多年前，在对矮牵牛进行研究中有个发觉：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素基因置于一个强开启子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵紫颜色，结果没看到期待深紫色花朵，多数花成了花斑甚至白。因为导入基因和其相同内源基因同时都被抑制，Jorgensen将这种现象命名为协同抑制。在真菌中也有类似现象，1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发觉这种现象。当初将这种现象命名为基因表答阻抑作用(quelling)［1］。   经过对转基因植物研究，发觉对应基因转录并不受影响，将这种现象称为基因转录后缄默。转录后基因缄默可能是进化过程中一个抵抗转座子和RNA病毒防御机制，可能在植物和动物分化之前就已经出现。1998年华盛顿卡耐基研究院Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心Craig Mello 首次将双链dsRNA 注入线虫，结果诱发了比正义链和反义链单独注射都要强基因缄默。将这种由dsRNA引发特定基因表示受抑制现象称为RNA干扰作用［2］。   2 RNAi分子机制   dsRNA能够介导基因缄默作用，以dsRNA为基点研究基因缄默分子机制成为热点。dsRNA指是大于30个碱基正确RNA分子。哺乳动物细胞有最少2条路径竞争双链RNA(dsRNA)，其一是特异性路径：特殊dsRNA序列用于RNAi，起始阶段dsRNA被切成siRNA。siRNA是RNA干扰作用赖以发生主要中间效应分子，能提供一定信息，允许一个特定mRNA被降解。siRNA正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，再每条链3’端都有2个不配正确碱基。  图1 siRNA  另一条是非特异性路径：只要有长dsRNA存在它能够降解全部RNA，抑制全部蛋白质合成。长dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活PKR经过一系列磷酸化关闭翻译起始因子，造成翻译抑制。也能够经过激活2’－5’AS 合成一个分子激活RNase L，造成非特异RNA降解［3］。   关于特异性RNA作用机制模型，包含起始阶段和效应阶段［4］。起始阶段dsRNA在Dicer酶作用下加工裂解21－23核甘酸长小分子干扰RNA片断［5］。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构。   在RNAi 效应阶段，siRNA双链结构解旋并形成有活性蛋白/RNA复合物，在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP［5］。由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合，随即切割mRNA从而达成在RNA水平干扰基因表示。RISC由多个蛋白成份组成，包含核酸酶，解旋酶和同源RNA链搜索活性等。   最新研究表明，Argonaute蛋白为RISC特有成份，被比喻成“切薄片机器”。Argonaute有一个月牙型底座由三部分组成，分别为N-端、中部和PIWI区域。在月牙底座上面有一个PAZ部分，由茎杆