(30)--实验：质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳.pptVIP

生物化学与分子生物学实验 实验学时：8 学时实验类型：综合性 每组人数： 2-3 人／组实验一 质粒DNA的提取及鉴定 实验目的熟悉碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的操作过程了解质粒的其他提取方法及质粒在基因工程中的应用掌握碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的原理 实验背景质粒（Plasmid)是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 5 质粒plasmid是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状质粒DNA1、部位不同：2、大小不同： 质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。 基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因质粒DNA与基因组DNA区别 pEGFP-N1质粒筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点筛选标记 多克隆位点 复制原点 质粒提取方法的选择决定使用不同的方法质粒的量质粒的纯度要求质粒的大小大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等，用不同的纯化方法 （满足各种转基因实验的要求）质粒过大：温和裂解法质粒大小适中：碱裂解，煮沸法 商业化质粒提取试剂盒11 二、实验原理 高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；②双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质 碱裂解法提取质粒的原理1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性， 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？ 留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后, 用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA. 三、仪器、材料与试剂 (一)仪器 1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．台式离心机 4．高压灭菌锅 (二)材料 1．含连接外源基因质 粒的E. coli 2．1.5mL Eppendorf管 3．吸头、微量移液器 Solution I 50mmol／L 葡萄糖 25mmol／L Tris·HCl(pH8.0) 10 mmol／L EDTA (三)主要试剂溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成 (保护、缓冲)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械剪切作用,防止破坏质粒 (保护作用)EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）Tris-HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用） Solution II 0.4mol/LNaOH，2％SDS, 用前等体积混合 溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 溶液III：HAc和 KAc组成的高盐溶液 (复性，分离)HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白