(31)--3.4.3凝胶层析的应用生物制药工艺学.docVIP

第三节 凝胶层析的应用 为了加深同学们对于凝胶层析基本原理和实验操作相关知识的理解，下面我们将对凝胶层析的部分应用做一个简单的介绍 由于凝胶层析操作简便，分离条件十分温和，活性丢失少，产品收率高，在生物化学及分子生物学实验室使用频率很高。凝胶层析分离机制简单，研究透彻，容易规模放大，近年来出现的许多刚性或半刚性凝胶介质，为凝胶层析的工业规模应用创造了条件。目前，生物制药领域已经出现1000升以上的凝胶柱，处理量已由克级向千克级迈进。 首先，我们来看一下浓缩与脱盐方面的应用。脱盐用的凝胶多为大粒度的，高交联度的凝胶。此时，溶液中蛋白质等大分子的排阻系数等于0，盐类的排阻系数等于1。由于交联度大，凝胶颗粒的强度好，加之凝胶粒度大，柱层操作比较便利，流速也高。用柱层析法脱盐时要求样品的体积必须小于凝胶柱的内水体积vi，在实际操作中，由于扩散作用的存在，样品体积最好不大于内水体积的1/3，以便得到理想的脱盐效果。 此外，还可以采用包埋法与直接投入法对样品进行脱盐，前者是将样品至于透析袋中，埋入干胶颗粒堆内，经过一定时间后，样品中的盐与水分一道被干胶交所吸收。直接投入法，则是将一定量的干胶投入盛样品容器，或直接使样品溶液从干胶柱上流下，以达到脱盐目的。这类方法，在拖延的同时，也进行了脱水，样品得到了浓缩，但只能脱去部分盐分。 不仅于此，凝胶层析还能在分子量测定方面得到应用。用凝胶过滤层析，测定生物大分子的分子量，操作简便，仪器简单，消耗样品少，且可以回收。测定的依据是不同分子量的物质，只要在凝胶的分离范围内，洗脱体积Ve及分配系数kd，随分子量增加而下降。对于特定的凝胶柱体系，待测定物质的洗脱体积与分子量的关系，符合以下公式，适中k与c是常数，分别为直线方程的斜率和外推截距。 根据此公式，分子量的测定方法有两种。一是求解法，选择两个已知分子量的蛋白质过柱，分别得到其分子量m1，m2，洗脱体积为Ve1，Ve2，根据公式，可列方程组，求得c和k的值，然后，便可利用未知蛋白的洗脱体积，求其分子量。第2种方法为标准曲线法，对于特定的测定系统，选取三个或以上的已知分子量标准蛋白过柱，并测取各自的Ve值。以ve做纵坐标，lgM做横坐标，制作标准曲线，在同一测定系统中测取未知物质的Ve值，由标准曲线便可求得分子量。标准曲线法所用标准蛋白的数量多，方法回归效果比求解法更好，准确性较高。用凝胶过滤法测得的分子量是近似分子量，误差往往在10%左右。此外，用相对保留体积或分配系数对分子量的对数作图也是直线，也可用于分子量测定。 目前，在生物制药过程当中也广泛地采用了凝胶层析技术。去热源往往是生产注射用生化药品的一个难题。应用较多的是各种吸附法，但由于吸附的专一性不强，一般都造成相当数量的产品损失或其他不利因素，用凝胶过滤法有时则比较方便。如用葡聚糖g-25，凝胶柱层析，去除氨基酸溶液中的热原性物质效果较好。对葡聚糖g-25来说，各种氨基酸的分配系数值几乎都等于1，而分子量巨大的热源物质分配系数值都等于0，能够起到很好的分离纯化作用，若上柱量不超过柱床体积的30%，分离效果可以达到生产目的。 采用凝胶层析技术对大分子物质进行分离与纯化也取得了良好的效果。研究者用葡聚糖g-50，纯化牛胰岛素和猪胰岛素，用该凝胶除去结晶胰岛素中前胰岛素和其他大分子抗原物质，这样可以大大改善注射用胰岛素的品质。另外，采用QAE葡聚糖a-25，制备单组份胰岛素也取得了成功，使得凝胶层析在胰岛素制剂生产中的应用得到了更多的扩展。 用葡聚糖凝胶分离多组份混合物，除利用分子筛效应外，还可以与利用某些物质与凝胶具有程度不等的弱吸附作用。如用葡聚糖g-25，分离催产素和加压素混合物。用葡聚糖g-25，分离氨基酸混合物，由于酸性氨基酸受到胶粒排斥，而先被洗脱，而芳香族氨基酸与胶粒存在弱吸附作用，故排出时间得到延长，碱性氨基酸则与胶粒吸附作用最强，所以最后排除，达到理想的分离纯化目标。 凝胶离子交换剂在分离纯化生化药物的应用已越来越广泛，还有用deae葡聚糖A-50，精制透明质酸酶，制备溶菌酶等。透明质酸酶的精制方法是用稀酸抽提睾丸丙酮粉，经硫酸氨盐析，透析后冻干粗品。粗品溶于水，经deae葡聚糖a-50凝胶层析，以0.02摩每升磷酸缓冲液洗脱精制后，可得电泳纯产品。deae葡聚糖a-25凝胶的使用在精制牛凝血酶方面也取得了突出的效果，所得产品比活力达到256个单位酶活每毫克。此外，研究者们同样使用deae葡聚糖a-25凝胶制备得到了固定化氨基酰化酶，并将此酶应用于手型氨基酸的拆分当中，成功地将化学合成得到的消旋氨基酸转变为左旋氨基酸，为该类氨基酸手性拆分的工业生产提供了依据。 本节课我们从凝胶层析的实际应用方面进行了详细的讲解，希望同学们可以对凝胶层析的知识加深了解，本次授课就到这里。