(31)--实验：质粒提取实验生物化学与分子生物学.pptVIP

一、琼脂糖凝胶电泳原理 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 DNA 分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 * 、 、 二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种海藻多糖，结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，可以分离200到50,000 bp 大小的 DNA 片断。 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 * 、 、 * * * 先介绍一下实验步骤和注意事项。离心机由学生操作。 * 置-20℃沉淀15-30min放映：温度控制系统。 * 提完质粒午休 * * * 质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 * 实验内容 一、碱裂解法小量制备质粒DNA 二、琼脂糖凝胶电泳检测DNA 实验学时：8 学时 实验类型：综合性 每组人数：2~3 人／组 * 实验目的 掌握碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的原理 熟悉碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的操作过程 了解质粒的其他提取方法及质粒在基因工程中的应用 * 一、碱裂解法小量制备质粒DNA 1. 实验背景 质粒（plasmid ）是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 * * 1. 实验背景 1、部位不同： 2、大小不同： 质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。 基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因。 质粒DNA与基因组DNA区别 1. 实验背景 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在；质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。 当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 * 以pEGFP-N1质粒为例 筛选标记 MCS（多克隆位点） 复制原点 * 实验背景——质粒的特点 筛选标记 多克隆位点 复制原点 * 1. 实验背景——质粒的应用 * 1)培养细菌使质粒扩增； 2)收集裂解细菌； 3)分离纯化质粒DNA。 质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤： √去除蛋白质 *酚-氯仿抽提法 √去除RNA *RNase消化 √去除基因组DNA 形成复合物 2.质粒提取的步骤 * 3.质粒提取方法的选择 决定使用不同的方法 质粒的量 质粒的纯度要求 质粒的大小 大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂 小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法 质粒过大：温和裂解法 质粒大小适中：碱裂解，煮沸法 * 4.实验原理(碱裂解法)  高碱 细菌的细胞壁破裂，内容物释放 ①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA； ②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。 ①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状； ②双链DNA并不完全分离。 高酸中和至中性 变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物 质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中 纯化 RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质 原理解读 强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。 怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除； 怎样去除蛋白质？ 留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后, 用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA. * 一、培养细菌使质粒扩增 碱裂解法提取质粒操作步骤 * 加入200?l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌； 二、细菌的裂解 细胞悬浮液（溶液I） 25 mmol/L Tris.HCl PH 8.0 任何生物化学反应，首先要控制好溶液pH 50 mmol/L 葡萄糖 悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管的底部 10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0 二价金属离子的螯合剂：抑制DNase的活性和微生物生长。 * 加入200?l细菌裂解液（溶液II），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。 注： 粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。 二、细菌的裂解 0.2mol/L NaOH 保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。细胞膜从双层膜结构向微囊结构