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数字对照品法检测镇静安神类中成药和保健食品中非法添加的5种西药成分 数字对照法是指将某些物质相对于特定物质的相对保留时间，并使用相对保留时间取代化学对照材料中某些物质的定位方法。该法常用于对照品价格昂贵或难获得的化学物质的定位, 在《中国药典》2010版二部中较常见, 如第707和831页盐酸克林霉素和氨曲南的含量测定、第396页阿奇霉素的有关物质检查都采用了相对保留时间来定位。镇静安神类化学药品如苯巴比妥、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、地西泮等均属于精神药品, 其中三唑仑为第一类精神药品, 购买上述药品的对照品, 应当经所在地省、自治区、直辖市人民政府药品监督管理部门批准, 向国务院药品监督管理部门批准的单位购买。由于其购买程序繁琐, 且价格较高, 建立一种简单、方便的替代方法对上述五种化学成分进行定性就变得尤为必要。 目前, 对于利用替代对照品法进行含量测定已有一定研究 1 药品与试剂 色谱仪:Agilent 1100 Series (色谱仪1) , Shimadzu LC-10ATvp (色谱仪2) , Waters 2690-2487高效液相色谱仪 (色谱仪3) ;色谱柱:Agela Venusil MP-C 对照药品:苯巴比妥片 (批号090402, 上海医药 (集团) 信谊制药总厂) 、艾司唑仑片 (批号2 0090209, 常州四药) 、阿普唑仑片 (批号090311420, 河南天方) 、三唑仑片 (批 江苏恩华) 、地西泮片 (批号090302, 上海医药 (集团) 信谊制药总厂) ; 样品:养血安神片、仁和健脑安神片、养血安神糖浆、安神补脑液、睡安胶囊、镇脑宁胶囊均为市售常用镇静安神类中成药和保健食品, 由本所监督室提供。试剂:乙腈为色谱纯, 甲醇、甲酸均为分析纯, 水为超纯水。 2 溶液的制备 2.1 混合对照溶液 取三唑仑片 (0.25 mg) 5片、阿普唑仑片 (0.4 mg) 3片、艾司唑仑片 (1 mg) 1片、地西泮片 (2.5 mg) 0.5片、苯巴比妥片 (30 mg) 1片, 研细, 置于25 ml量瓶中, 加甲醇适量, 超声10 min, 放冷, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 取续滤液 (过0.45μm滤膜) , 即制得混合对照溶液。 2.2 试验溶液 取6种镇静安神类中成药和保健食品, 以上述混合对照溶液为溶剂, 每个样品平行制备2份样品溶液。具体制备过程见参考文献 3 在铬条件下，系统的适用性 色谱柱:Agela Venusil MP-C 4 基本原则 在多指标质量评价时, 以样品中某一典型成分 (对照品易获得者) 为替代对照品, 建立该成分与其他成分间的相对保留时间α, 如α 5 连续进样2次 精密吸取混合对照品溶液20μl进样测定, 连续进样3次, 取平均值。以苯巴比妥为替代对照品 (S) , 艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、地西泮为待测成分 (i) , 按公式α 5.1 不同色谱柱对苯巴比妥-其他药品保留时间的影响 HPLC测定时会用到不同品牌的同类型色谱柱, 使用同一台液相色谱仪Agilent 1100 Series高效液相色谱仪 (色谱仪1) , 分别用5种不同品牌、尺寸、填料的色谱柱测定对照药品苯巴比妥和其他4种药品的保留时间, 计算α值见表1, 考察更换不同色谱柱对α值的影响。由表1可以看出在同一台高效液相色谱仪上, 更换不同品牌的色谱柱对α值影响不大。 5.2 高效液相色谱法 HPLC的柱温箱存在偏差, 用同一台液相色谱仪Agilent 1100 Series高效液相色谱仪 (色谱仪1) , 分别在20、25、30、35、40℃用相同的色谱柱Agela Venusil MP-C 5.3 高效液相色谱仪 HPLC的流速直接影响保留时间, 用同一台液相色谱仪Agilent 1100 Series高效液相色谱仪 (色谱仪1) , 分别在0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml·min 5.4 不同高效液相色谱仪对值的影响 用Agela Venusil MP-C 由表4可以看出, 不同高效液相色谱仪对α值影响不大。在实际检验工作中, 不同色谱柱和不同仪器是主要变化因素, 用“不同品牌同类型色谱柱”和“不同液相色谱仪”求得的α值平均值计算, 见表5。 6 样品测定 为考察样品中的辅料对苯巴比妥等五种化学成分出峰时间的影响, 以经过筛查 7 苯巴比妥对照品对5种活性成分的相对保留时间和重现性的影响 本试验成功建立了数字对照品法对苯巴比妥等五种化学成分进行定性检测, 艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、地西泮与苯巴比妥的相对保留时间分别为1.9、2.2、2.6、3.4。选用苯巴比妥作替代对照品, 建立该成分与其他4种成分间的相对保留时间 (α) 是由于苯巴比妥的对照品与其