铜绿假单胞菌产金属-内酰胺酶检测及其耐药性分析.docxVIP

铜绿假单胞菌产金属-内酰胺酶检测及其耐药性分析 铜绿假单胞菌（pa）是医院感染的主要病原体。临床样品的检测率和多重药物的选择率都很复杂。目前, 临床上使用碳青酶烯类抗生素治疗多重耐药的PA, 但近年来其耐药率有明显的上升趋势, PA对碳青酶烯类抗生素的耐药机制主要是由bla-Mp基因产生的质粒介导的β-内酰胺酶, 即金属β-内酰胺酶 1 1.1 pa的耐药鉴定 选择我院2005年8～11月从不同患者送检标本中分离的105株PA, 其中对亚胺培南和头孢他啶同时耐药者22株。以铜绿假单胞菌ATCC27853产IMP-1型金属酶标准菌株作为质控菌株。 1.2 环保纸和培养基 所有E-test为瑞典AB BIODISK公司产品, K-B法纸片为OXID产品, M-H培养基为法国梅里埃公司产品。 1.3 方法 1.3.1 识别菌株 采用VITEK-32系统 (法国Bio-Merirux) 进行鉴定。 1.3.2 抗生素敏感试验 采用E-test进行药物敏感性试验及MIC值检测, 结果判断按照NCCLS文件M100-S15 (2004年版) 推荐的标准 1.3.3 空白滤纸片的制备 采用头孢他啶 (CAZ 30μg) , 亚胺培南 (IPM 10μg) 纸片。用棉拭子将0.5麦氏单位菌悬液涂于M-H平板上, 在平板中贴上IPM和CAZ纸片, 两纸片相距4cm。在距IPM、CAZ各1cm的地方分别贴上空白滤纸片。并将配制好的10μl 0.5M EDTA (pH8.0) 溶液加在空白滤纸片上, 35℃孵育24h, 观察结果。头孢他啶或亚胺培南纸片与EDTA纸片间有协同现象判断为产金属酶阳性。 1.3.4 脉冲场凝胶电泳 制胶块:分别挑取20株铜绿假单胞菌的新鲜单个菌落接种至3ml LB中, 振荡培养6～8h, 取1.2ml12000/min离心1min集菌。1ml CSB悬菌洗涤, 8000/min离心3min, 洗3次。最后取200μl中有数CSB悬菌, 置42℃水浴10min。将菌悬液与2%低熔点琼脂糖凝胶 (含1%SDS) 等体积混合, 将混合物加入模具孔中制成胶块, 4℃10min冷却。 蛋白消化:用模具梳子将胶块直接取出, 投入3mlCLB溶液 (含MERCK公司蛋白酶K 0.2mg/ml) , 54℃水浴轻摇过夜。弃液, 加5ml 50℃预热的纯水, 轻摇至胶块悬起, 50℃水浴轻摇10min。洗2次, 5ml 50℃预热的TE洗胶块4次, 15min/次, 凉至室温, 加3ml TE, 置4℃保存。 酶切:切1～3mm胶块, 浸入150μl酶切体系中 (其中含speI酶20U) , 37℃过夜。 制胶:称取1g脉冲场级琼脂糖 (BIO-RAD公司) 溶于100ml, 0.5×TBE缓中液中, 加热溶解后冷至60℃, 将酶切后的样品胶置于样品梳上, 摆放到模具上。将琼脂糖缓缓倒入模具中, 冷却20min后, 拔去样品梳, 去除挡板, 将胶块放入已加入0.5×TBE缓冲液的电泳槽中。 电泳:电压6V/cm, 电泳20h, 脉冲参数5～15s, 电泳时间10h, 15～45s, 10h, 电泳角度120°, 温度14℃。 染色:电泳结束后, 将凝胶取出, 用0.5μg/ml的Goldview染色30min, 去离子水脱色30min。 读胶:用BIO-RAD公司Versa Doc 3000型荧光成像仪读胶分析。 2 耐头孢他啶和亚胺培南铜绿假单胞菌的产金属酶率及mic值 2.1 105株PA的耐药性分析 9种抗菌药物对铜绿假单胞菌敏感率分别为:哌拉西林/他唑巴坦75.19%、头孢他啶64.0%、阿米卡星44.5%、环丙沙星64.32%、头孢哌酮/舒巴坦70.12%、亚胺培南79.1%、氨曲南58.32%, 哌拉西林47.62%, 头孢吡肟51.43%。 2.2 22株耐头孢他啶和亚胺培南铜绿假单胞菌的产金属酶率及MIC值 22株菌株中, 有7株产金属酶, 产酶率为31.8%。其MIC值见表1。 2.3 7株产金属酶PA的脉冲场凝胶电 (PFGE) 泳分析 PFGE条带判读标准:有1～3条不同条带的菌株为同一克隆, 有6条以上不同条带为流行病学无关的不同克隆。7株PA中有4个克隆株:A克隆株为1、2、7, B克隆株为3、5, C克隆株为4, D克隆株为6。追踪分析A克隆株的1、2、7菌株均来自同一病区。 3 抗菌药物的耐药机制 目前铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗生素的耐药有一部分是由于产生了金属酶。金属β-内酰胺酶MP-1属内酰胺类Bush分类的3a, 因其分子含有Zn 为了研究7株产金属β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌是否有相同的来源, 我们进行了脉冲场凝胶电泳分子生物鉴定。进一步证实了尽管大多数金属β-内酰胺酶由染色体编码, 但也可由质粒携