不同产地山茱萸中没食子酸、莫诺苷及马钱苷成分含量的测定及临床意义.docxVIP

? ? 不同产地山茱萸中没食子酸、莫诺苷及马钱苷成分含量的测定及临床意义 ? ? 周瑞静 田港 陈颖君 郭沅琪 周泓宇 俞薇 单琪媛 郑平汉 山茱萸为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，具有补益肝肾、涩精固脱的作用［1］。现代药理研究显示，山茱萸的主要成分有环烯醚萜类、黄酮、有机酸类等［2-3］，而环烯醚萜类的含量相对较高，其中含量较高的是莫诺苷和马钱苷，能够缓解骨性关节炎、调节免疫、缓解神经痛等［4-8］。品种、种植环境及气候条件等因素均可影响山茱萸药材有效成分的物质积累差异，进而产生临床疗效和经济价值的差别［9］。河南、陕西为山茱萸目前最大的产区，浙江临岐有较丰富的野生山茱萸资源。野生因素、产地、品种对山茱萸成分含量的影响尚无报道。本文采用超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）指纹图谱［10］比较不同产地与浙江野生山茱萸不同品种整体特征，并定量分析没食子酸、莫诺苷、马钱苷等三种指标成分，以期为浙产道地药材山茱萸的野生资源保护、山茱萸优种优育与药材质量提升提供参考，为临床药效保障提供基础支持。 1 材料与方法 1.1 仪器设备 ACQUITY UPLC H-Class Plus系列超高效液相色谱仪（美国Waters公司），BSA124S电子天平（0.1 mg，sartorius，Germany），SQP电子天平（0.01 mg，sartorius，Germany），KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。 1.2 材料及试剂 没食子酸（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST，莫诺苷（乐美天医药，德思特生物，批号：DST200303-039），马钱苷（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST，磷酸、甲醇、乙腈为色谱纯，水（超纯水，Unique-S*型多功能超纯水系统，锐思捷水纯化技术有限公司）。山茱萸的采购、产地及批次信息，见表1，并经由浙江中医药大学秦路平教授鉴定。 表1 山茱萸的产地及批次信息 1.3 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）。流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序见表2，流速为0.3 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃，进样量为0.5 μL。混合对照品溶液及山茱萸样品溶液的色谱图，见图1。 图1 混合对照品溶液（A）及山茱萸供试品溶液（B）的UPLC色谱图 1.4 混合对照品溶液的制备 精密称取马钱苷、莫诺苷、没食子酸对照品适量，置10 mL容量瓶中，加体积分数为80%甲醇溶解定容，分别制成浓度为30、200、120μg/mL的对照品溶液。 1.5 山茱萸供试品溶液的制备 精密称取过3号筛的山茱萸粉末0.200 g，置25 mL锥形瓶中，加体积分数80%甲醇溶液定容至刻度，称重，超声提取（功率300 W，频率40 kHz）45 min，取出，再称重，补足丢失的质量，取上清液过0.22 μm微孔滤膜作供试液。 1.6 方法学考察 （1）线性关系考察：取对照品溶液，用体积分数为80%的甲醇溶液逐级稀释，制备7个浓度梯度的混合对照品溶液，按色谱条件进样测定。（2）精密度试验：取山茱萸（S4）供试品，按色谱条件连续进样6次。（3）重复性试验：取同一批山茱萸（S4）供试品6份，制备供试品溶液，按色谱条件进样测定。（4）稳定性试验：取山茱萸供试品溶液，按色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定。（5）加样回收率试验：取同一批山茱萸供试品（S7）6份，分别精密加入等量的各对照品，制备供试品溶液，按色谱条件进样测定。 1.7 样品含量测定 取12批山茱萸样品制备山茱萸供试品溶液，按色谱条件进样测定。 1.8 指纹图谱的建立 将12个不同产地、批次的山茱萸UPLC图谱以CDF格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.130723版本），将S1号批次（浙江省杭州市淳安县临岐镇审丰村2019年采收）谱图作为对照谱图，采用中位数法，产生参照图谱，以多点校正法对各个色谱峰的保留时间进行校正，校正的mark峰选择没食子酸、莫诺苷、马钱苷3个共有峰。 1.9 聚类分析 相似度计算结果应用SPSS软件，参数设置为欧式距离，采用ward聚类方法计算。 2 结果 2.1 山茱萸中三种成分线性关系考察结果 三种成分在相应的浓度范围内与峰面积的线性关系良好，以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性方程，见表3。 表3 山茱萸中三种成分线性关系考察结果 2.2 方法学考察的精密度、重复性及稳定性试验结果 以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性方程，精密