不同产地杜仲雄花的非靶向代谢组学比较与分析.docxVIP

? ? 不同产地杜仲雄花的非靶向代谢组学比较与分析 ? ? 孟益德，吕庚鑫，刘攀峰，赵 培，杜红岩，杜兰英 （1.国家林业和草原局 泡桐研究开发中心，河南 郑州 450003；2.南京林业大学，江苏 南京 210037；3.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；4.经济林种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，河南 郑州 450003；5.河南省产品质量监督检验院，河南 郑州 450003） 杜仲Eucommia ulmoideOliv.是第四纪冰川侵袭后留存于我国的单种属孑遗树种，也是目前我国重要的经济林树种[1]。杜仲雄花是我国珍贵的花粉资源，富含多种人体健康有益成分，已开发出杜仲雄花茶、保健酒、养生挂面、功能饮料等系列产品，在市场上倍受青睐[2]。迄今在杜仲雄花中发现黄酮类、苯丙素类、环烯醚萜类、木脂素类等活性物质[3]，以京尼平苷、桃叶珊瑚苷、绿原酸、异槲皮苷的研究最为广泛和深入[4-5]。已证明杜仲雄花具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、抑菌、抗老化等药理作用[6]。2014年，杜仲雄花被我国国家卫生委员会列入新资源食品名录[7]。 近年来代谢组学技术已广泛地应用于中药材质量控制与品质评价、资源鉴定、植物分类、亲缘关系评估以及代谢调控网络等领域[8-9]。应用UPLC-QTOF/MS 并结合多维统计分析方法将黄岑野生居群划分为3 种化学型，鉴定出4个差异代谢物，可用于区分不同产区的黄芩[10]。也有研究通过非靶向代谢组学方法发现不同茶树群体中代谢物含量差异显著，并且各种群具有各自的特征代谢物[11]。基于LC-ESI-Triple TOF-MS/MS 技术对杜仲雄花中32 种化学成分进行了分析鉴定，结果表明，杜仲雄花化学成分与杜仲皮相似，但是雄花的黄酮苷类成分含量高于杜仲皮[12]。 杜仲雄花代谢成分是品质形成的重要因素[13]，但对杜仲雄花品质性状区分的物质基础尚不明确。以往研究多集中在少数代谢成分的测定和评价方面[14-15]，尚未利用代谢组方法进行整体和系统研究，而这对于杜仲雄花种质资源鉴定、评价以及代谢成分的生物合成机制研究极为重要。 杜仲在我国亚热带至温带的27 个省份均有分布[1]。贵州省遵义市是杜仲药材的道地和主要产区，河北省安国市、四川省广元市为我国传统的杜仲药材生产基地，而洛阳市和新乡市为河南省新型杜仲资源培育的主要聚集区之一[16-17]。因此，本研究通过对5 个典型产地的杜仲雄花进行UPLCQTOF/MS 代谢组学分析，解析不同杜仲种质雄花代谢成分的整体性差异，为后续全面开展杜仲种质资源精准评价提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 采样树树龄6 a，采自于中国林业科学研究院经济林研究开发中心杜仲国家种质资源库，地理坐标34°55′N，113°36′E，不同种质立地条件以及管理方式基本一致。2018年采集2～4 株样树盛花期的新鲜雄花，每种质6 个生物学重复。除去鳞片和混生在雄花序内的小叶后置50 mL 离心管内液氮冷冻，带回室内-80℃保存。 1.2 杜仲雄花形态性状的测定 分别测定5 份种质枝皮颜色、雄花序形状、雄花颜色、雄花序数量、单雄花序鲜质量、雄花序长度、雄花序宽度、雄花数量、雄花长度、雄蕊数量以及雄蕊长度等11 个形态指标，每个指标测定10 个生物学重复。 1.3 提取液的制备 称取100 mg 杜仲雄花进行液氮研磨，之后向样品中加入120 μL 预冷的50%甲醇，涡旋1 min，室温下孵育10 min，将提取混合物在-20℃下储存过夜。4 000 r/min 离心20 min，上清液转移至96孔板，待LC-MS 分析。每个样品取10 uL 进行合并制备QC 样品。 1.4 UPLC-QTOF/MS 分析 利用超高效液相色谱(SCIEX，UK)系统进行物质分离和高分辨质谱TripleTOF5600plus (SCIEX，UK) 对样品进 行物质鉴定。液相分析条件：1) 色谱柱(Waters ACQUITYUPLC BEH Amide column)1.7 μm，2.1 mm×100 mm；2) 流动相A 为水+25 mmol 乙酸铵+25 mmol 氨水，B 为乙腈(加0.1%甲酸)；3) 梯度洗脱条件：0～0.5 min，95% B；0.5～9.5 min，95%～65% B；9.5～10.5 min，65%～40% B；10.5～12 min，40% B；12～12.2 min，40%～95% B；12.2～15 min，95% B；4) 柱温35℃，流速0.4 mL/min，每个样品的进样量为4 μL。分别采用电喷雾电离正离子(ESI+)和负离子(ESI-)模式检测柱中洗脱的代谢物，质谱条件：离子源温度650℃，质谱电压5 0