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核桃内生生防菌h-q6的研制 近年来，随着对食品安全、污染控制和生态平衡等诸多问题的关注，减少了化肥和农药的使用，微生物酶和生态菌肥的开发和开发已成为植物和农药学术界的热点。 生防菌剂的剂型较多的是可湿性粉剂、悬浮剂及颗粒剂, 其中, 乳悬剂为悬浮剂中的一种, 是以溶剂油为主要成分, 添加不同的助剂, 如乳化剂、抗生素、防冻剂等, 加工制成高效无公害、性质稳定、对人和环境安全的微生物农药制剂 本试验以Ht-q6菌株为材料, 以目前生产上危害严重的番茄早疫病菌为指示菌, 通过助剂的筛选, 按照国家质量标准, 研制出生防菌Ht-q6乳悬剂, 旨在为生产上开发应用提供资源。 1 材料和方法 1.1 试验材料 供试菌株为生防菌Ht-q6和番茄早疫病菌 (Alternaria solani) , 均由山西农业大学植物病理实验室提供。 1.2 药物、防冻剂和润湿剂 溶剂油为芥末油、花椒油、芝麻油、花生油、胡麻油。乳化剂为吐温-80和OP-10。抗生素为两性霉素、灰黄霉素、制霉菌素。防冻剂为氯化钙、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇。润湿剂为十二烷基苯磺酸钠, 洗衣粉, D-317, DCM-82。稳定剂为Ca CO 1.3 测试方法 1.3.1 活化菌株培养 用接种环挑取生防菌Ht-q6, 通过平板划线培养法, 将其接种于NA平板上进行活化培养24 h, 然后将活化菌株接种到100 m L NB培养液中, 接种量1%, 置于摇床上, 以30℃, 180 r/min速度振荡培养72 h, 芽孢率≥90%。 1.3.2 分生孢子法培养 取番茄早疫病菌接种在PDA平板上, 将其置于26℃恒温培养箱中培养7 d后, 用无菌刀把培养物切成5 mm×5 mm的菌块, 接入水琼脂培养液中, 黑暗放置3 d后产生大量分生孢子, 用无菌水稀释振荡均匀, 得到浓度为10 1.3.3 生防菌ht-q6乳液 1.3.3. 芽孢存活率测定 溶剂油:取1 m L生防菌Ht-q6发酵液分别加入到10 m L不同的溶剂油中, 置于小锥形瓶内, 密封后室温下贮存, 并定期取0.1 m L加入到10 m L的NB培养液中, 测定其芽孢存活率。 乳化剂:将选出的最佳溶剂油取10 m L置于小锥形瓶中, 分别加入1 m L的吐温-80, OP-10及吐温-80和OP-10 (体积比为1∶1) 的混合物, 再向其中加入1 m L的发酵液, 振荡均匀后, 测定芽孢存活率。每隔7 d取0.1 m L分别加入到10 m L不同浓度的最佳乳化剂中, 振荡均匀后测定芽孢存活率。 以上各处理均在 (25±1) ℃下摇床振荡培养, 每个处理重复3次, 用平板菌落计数法测定并记录不同时间芽孢存活率, 以芽孢存活率的高低判定溶剂油优劣以及测定不同乳化剂对芽孢活性的影响。 1.3.3. 润湿剂和稳定剂的筛选 将4种润湿剂 (10%) 和4种稳定剂 (2%) 分别添加到已经筛选出的上述配方中, 测定添加润湿剂和稳定剂后的悬浮率、润湿时间和芽孢存活率, 每个处理3次重复, 以不加润湿剂和稳定剂的配方为对照, 筛选出最佳润湿剂和稳定剂。 1.3.3. 保护剂的筛选 将4种保护剂按10%分别加到已制备的乳悬剂中, 测定添加保护剂的悬浮率、润湿时间, 以不加保护剂为对照, 在254 nm紫外灯下距离40 cm处照射6, 12, 24 h后计算芽孢存活率。 1.3.4 活菌数测定 取2 m L试样和18 m L的无菌水置于100 m L的锥形瓶内, 振荡均匀。采用平板菌落计数法测定活菌数, 每隔6 d测1次, 当活菌数出现大量减少时, 改为每隔3 d测一次, 直到活菌数接近于零, 记录测量间隔时间及活菌数。根据稀释倍数计算出1 m L样品中的活菌数。 1.3.5 平板菌落计数法 参考《中华人民共和国农业部标准》 (GB 4789.2—2010) , 采用平板菌落计数法, 测定制剂的芽胞含量。即将乳悬剂按10倍梯度依次稀释7次后, 取最后稀释液0.1 m L均匀涂布于平板上, 计算菌落数。根据公式计算菌株存活率 (S 其中, M为含生防菌的乳悬剂在NA平板上的菌落数 (cfu/g) ;M 1.3.6 性能的测定 按照《中华人民共和国国家标准》对生防菌Ht-q6乳悬剂的各项质量指标进行测定, 如倾倒性、热贮稳定性、低温稳定性、杂菌率、p H和细度。 倾倒性的测定按HG/T 2467.5—2003方法。热稳定性的测定按GB/T 19136—2003方法。低温稳定性的测定按GB/T 19137—2003方法。悬浮率的测定按照GB/T 14825—2006方法;p H值测定按照GB/T 1601—1993方法。 1.3.7 生防菌ht-q6乳液的安全性评价 1.3.7. 接种法:变革培养,引进菌种,并将番茄苗打造成菌悬液的土