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针叶树离体培养与植株再生技术研究进展 针叶树的远离体培养和植物育种是植物组织培养研究中很难解决的一个领域。随着人们对无性系林业的日益重视, 世界各国对针叶树的组织培养给予了特别关注。经过近20年的发展, 针叶树已从组织、器官培养深入到细胞、原生质体培养逐步实现从理论研究到应用实践的跨越, 尤其在离体培养与植株再生各环节技术指标上取得了重大突破。然而纵观全球针叶树组织培养, 仅有少数几个树种的体胚发生技术在生产上得到应用大部分组织培养技术仍停留在实验室研究阶段尤其是在松属树种中仍存在不少困难。火炬松 (Pinus taeda L.) 是针叶树中少数几个组织培养技术相对成熟的树种之一, 系统了解其培养技术研究及应用进展, 对同类树种相关研究的开展具有借鉴意义。 火炬松原产美国东南部, 是世界南方松中分布最广、生长面积最大、木材年产量最高、蓄积量最多的绿化和造林用速生针叶树种, 上世纪30年代引入我国, 目前已成为我国南方省区大面积造林的重要经济树种。火炬松的组织培养研究始于上世纪70年代。1987年Gupta和Durzan首次从改良的MS培养基上, 以未成熟合子胚为外植体, 获得火炬松体细胞胚和再生植株。之后, 对火炬松不定芽诱导、体细胞胚发生和植株再生技术的研究不断深入, 并取得了很大进展。 1 体胚发生途径 通过组织培养获得火炬松再生植株有器官发生和体细胞胚胎发生2种途径。器官发生包括直接发生和间接发生2种方式, 直接器官发生耗时短操作简便。间接器官发生需先诱导愈伤组织, 再经器官分化形成再生植株, 愈伤组织培养不受季节限制, 污染率低, 诱导率高。体胚发生途径则多通过间接方式发生, 即先诱导生成胚性愈伤组织 (胚性胚柄团) , 再从胚性愈伤组织诱导体细胞胚并使其成熟和萌发, 进而得到完整植株。通过体胚发生获得再生植株的优点是, 在一个培养物上所能发生的胚状体数量往往比不定芽数多, 且发生速度快, 结构完整, 无需诱导生根环节, 成苗率高。对于火炬松, 这2种发生途径都有其重要意义。 1.1 再生植株的选择 火炬松的组织培养研究始于上世纪70年代。之后相继有研究以成熟合子胚为外植体直接诱导形成不定芽, 并经根的诱导获得了再生植株 (阙国宁等1997;唐巍等1997;Tang和Guo 2001) 。唐巍和欧阳藩 (1998) 还通过成熟合子胚培养获得了器官性愈伤组织, 从愈伤组织诱导不定芽, 并诱导芽苗生根获得了再生植株, 不定芽的诱导率达58.2%, 生根率达46%。 1.2 生理生化及生物学研究 1987年Gupta和Durzan以火炬松未成熟合子胚为外植体, 首次经体胚发生途径获得再生植株。此后, 有关研究大量开展, 火炬松体胚发生再生植株成功的研究越来越多, 生理生化及分子生物学方面的研究也得以深入 (Becwar等1990;唐巍等1998) 。其中唐巍等 (1998) 以24个火炬松基因型成熟种胚为外植体, 获得完整植株, 成活率最高达25%。在此基础上, 生物反应器、低温冷藏技术及人工种子生产等应用研究也得以迅速发展。这些技术的发展也大大促进了火炬松体胚发生植株再生技术的应用。据报道, 美国Weyerhaease公司和Westvaco公司已将火炬松体胚发生技术应用于苗木商业化生产。 2 影响植物再生的主要因素是火炬松离体培养 火炬松组织培养过程受多种因素的影响, 了解这些影响因素的作用规律将有利于火炬松的快速繁殖和工业化生产。 2.1 体胚诱导发育的期次 到目前为止, 火炬松成功的离体培养所使用的外植体均为合子胚。器官发生植株再生以成熟的合子胚为外植体, 不定芽或器官性愈伤组织通常发生于子叶或下胚轴 (Tang和Guo 2001;阙国宁等1997) 。体胚发生多以幼嫩合子胚为外植体, 发育早期太小的合子胚不容易剥离, 此时可用包含合子胚的雌配子体接种 (Gupta和Durzan 1987) 。合子胚的发育阶段是影响体胚发生的一个主要因素, 通常适合体胚诱导的发育阶段只是一个很短的时间。Becwar等 (1990) 研究发现, 7月6日到8月3日取材的合子胚上获得体胚的最高诱导率, 同时发现体胚诱导与合子胚的形态学密切相关, 合子胚长度小于0.5 mm时 (在子叶原基发育之前) 最适合诱导体胚。唐巍等于1998年打破了幼嫩合子胚发育状态和取材季节的束缚, 首次以成熟合子胚为外植体建立了体胚发生和植株再生技术体系, 尽管再生频率只有6.1%~18.4%。 2.2 火炬松体胚的诱导 不同基因型的外植体需要的最适培养条件不同, 而在相同诱导条件下, 其不定芽诱导和体胚发生情况有明显差异。 对3种基因型 (Hb、Ma和Mc) 火炬松不定芽诱导的研究发现, 不同基因型不定芽的分化、伸长、生根情况有显著差异。其中, 基因型Hb的