一种新型的生化工程提高溶栓新药瑞替普酶生产得率的中试研究.docxVIP

一种新型的生化工程提高溶栓新药瑞替普酶生产得率的中试研究 瑞利普酶是retepra的中文名称。这是由实验室用互补基因工程方法获得的组织纤溶酶原激生剂（t-pa）的异构体。主要用于脑梗死、梗死和其他血栓形成疾病。笔者构建的工程菌BL21, 在LB培养基中表达, 经过测定其分子量为39.6kD, 未糖基化, 单链, 临床实验具有显著溶解血栓效果, 是正在处于二期临床阶段的国家二类新药, 约有10亿元的市场, 下一步产业化的主要问题是降低生产成本。国外只有德国宝灵曼 (Boehringer Mannheim) 公司生产销售, 商标名为Retevase, 他们使用谷胱甘肽还原法进行瑞替普酶的复性, 得率不超过5%, 生产成本居高不下。笔者使用了生化工程复性的方法——PDI辅助复性, 得率达到15%以上, 在指导工业化生产中具有重要意义。 1 1.1 发酵罐发酵 将工程菌pTPA3/BL21进行活化, 然后用LBA培养基制备一级和二级种子液 (37℃培养) 后, 分别用50L和100L自动发酵罐发酵, 发酵温度为37℃, 进行O.D. 1.2 盐酸醚和二硫苏氨酸组 将包含体离心, 用6mmol/L盐酸胍和100mmol/L?二硫苏氨酸 (DTT) 使其溶解并变性。 1.3 复性液的制备 在变性的酶液中按变性酶液:蛋白质二硫键异构酶 (PDI) =50∶1的分子摩尔数的比例加入重组蛋白质二硫键异构酶 (rhPDI) , 同时加入谷氨酸 (GSH) ∶谷胱甘肽 (GSSH) = 1mmol/L∶0.2mmol/L作为还原环境, 室温放置24h, 过滤去除微量不溶物, 即得瑞替普酶的复性液。 蛋白质二硫键异构酶 (rhPDI) 由山东元隆生物技术有限公司用基因重组方法构建。 复性率的计算方法:经亲和层析柱吸附和洗脱得到的正确折叠的r-PA占变性r-PA的摩尔分数即为r-PA的复性率。 1.4 lys柱亲和层析和cm-排多克隆柱亲和层析分离纯化 将复性液浓缩、脱盐, 用Lys柱亲和层析和CM-Sepharose阳离子交换层析的方法进行分离纯化 1.5 蛋白平板溶圈法 纤维蛋白平板溶圈法和S 1.6 与谷胱甘肽还原法比较 瑞替普酶得率 (产率) 用每升发酵液中收获的瑞替普酶的毫克数进行计算, 结果与本实验室和德国宝灵曼公司的谷胱甘肽还原法的得率进行比较。 2 2.1 pdi辅助复性以及纯化的瑞替普酶 经过实验, 选择6mol/L盐酸胍和100mmol/L?DTT作为变性剂, 可使绝大部分瑞替普酶溶解并充分变性。用SDS电泳检查裂解的菌体, 在39kD处有明显的瑞替普酶蛋白表达条带, 分离的包含体中含有80%的瑞替普酶。 用PDI辅助催化复性的方法, 其复性率稳定在15%以上。由于复性液中未正确折叠的瑞替普酶仍占多数, 需要再经过亲和层析和阳离子交换层析纯化, 可得到纯化的瑞替普酶。 经SDS银染和Protein C 2.2 复性体的选择 重组的工程菌在表达瑞替普酶时, 由于瑞替普酶分子中含9对二硫键, 因二硫键错配形成致密的没有活性的包含体, 要获得有活性的瑞替普酶, 就必须将包含体破碎变性再复性, 以降低错配率获得工业生产上具有商业价值的产品, 关键是找到适宜于工业化生产的复性方法。 瑞替普酶的18个Cys在体外自行正确配对成9个二硫键并正确折叠成有活性的溶栓酶的机率非常低, 即便在GSH/GSSG这样的有利于二硫键配对的还原/氧化环境中机率仍不高。根据本实验室的实验数据, 瑞替普酶的复性率不超过2% (Boehringer Mannheim公司为5%) , 大多数为二硫键错配的异构体。本实验经过多次探索, 最终采用在原复性体系中加入人蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 的方法可以提高复性率。其原理是PDI能特异性地催化巯基/二硫键交换反应