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克氏原螯虾蛋白肽的制备及抗氧化性研究 近年来，随着生活水平的提高，克氏原虾因其独特的口感、丰富的蛋白质、矿物质和高含量而越来越受到重视。 克氏原螯虾虾头及其副产物是良好的蛋白质来源, 采用酶解法来提取蛋白质, 具有易于控制、反应温和、对氨基酸破坏小等特点。郑捷等以虾副产物为原料, 通过酶解工艺制备复合调味料 许多食品在加工过程中, 容易发生氧化作用, 而氧化会影响感官品质、降低营养, 甚至产生有毒物质 本实验以克氏原螯虾副产物为原料, 利用酶解法进行蛋白肽提取工艺的优化, 并对酶解后的蛋白肽进行抗氧化性质研究以及氨基酸成分分析, 为虾副产物综合利用的新途径提供理论依据, 对增加克氏原螯虾副产物的综合利用率、提高经济效益有重大意义。 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 克氏原螯虾副产物江西海浩鄱阳湖水产有限公司;木瓜蛋白酶Papain南京庞博生物工程有限公司;碱性蛋白酶 (Alcalase 2.4FG) 、风味蛋白酶 (Flavourzyme500MG) 、中性蛋白酶 (Neutrase 1.5 MG) 、复合蛋白酶Protamex丹麦诺维信有限公司;1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, DPPH) 美国Sigma公司;氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、三氯乙酸、三氯化铁、水杨酸等试剂均为分析纯, 购于南康市华亿化工有限公司。 JJ-2高速组织捣碎机上海标本模型厂;DELTA-320精密pH计梅特勒-托利多国际有限公司;85-1磁力搅拌器江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;TDL-5A离心机上海费洽尔分析仪器有限公司;UT-12电热鼓风干燥箱上海三发科学仪器有限公司;SX2-4-10箱式电炉上海嘉益电炉有限公司;UV-1000型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 原材料预处理 将虾壳副产物在电热鼓风干燥箱中50℃烘干, 粉碎机粉碎, 密封保存于干燥环境中以备用。 1.2.2 理化指标及分析方法 水分测定:直接干燥法, 参考GB 5009.3-2010;灰分测定:550℃干法灰化法, 参考GB 5009.4-2010;脂肪测定:索式提取法, 参考GB/T 14772-2008;总糖测定:分光光度法, 参考GB/T 9695.31-2008;粗蛋白质含量:凯氏定氮法, 参考GB 5009.5-2010。 1.2.3 酶分解蛋白质 1.2.3. 虾壳蛋白酶活性测定 称取5g虾壳粉, 分别选取木瓜蛋白酶Papain、中性蛋白酶Neutral Protease、碱性蛋白酶Alcalase、风味蛋白酶Flavourzyme、复合蛋白酶Protamex进行实验, 调节体系分别维持在各蛋白酶的最适pH值、最适酶解温度, 料液比均为1∶10, 加酶量为虾壳粉蛋白质含量的2%, 酶解3h后沸水浴灭酶10 min, 离心 (4000r/min, 10min) , 测定上清液中的蛋白质含量。5种蛋白酶的酶解条件见表1。 1.2.3. 2.蛋白质水处理 1.2.3. 蛋白质水解度的影响因素 选取最优蛋白酶后, 采用单因素实验研究酶解时间、酶解温度、pH值、料液比、加酶量对虾壳蛋白质水解度的影响。在单因素实验的基础上, 设计正交实验进行酶解工艺的优化, 单因素实验设计见表2。 1.2.4 抗氧化性测定 1.2.4. 1sdph自由基去除能力 取2mL样品溶液和2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合, 在室温下避光放置30min, 于517nm下测其吸光度A 1.2.4. 过氧化氢用于测定样品、测试方法 依次加入1mL 9mmol/L硫酸亚铁、1mL样品溶液、1mL 8.8mmol/L过氧化氢溶液、1mL 9mmol/L水杨酸-乙醇溶液, 37℃水浴30 min, 510nm下测吸光度A 1.2.4. 铁氰化钾的合成 于试管中加入1mL样品, 依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸缓冲液 (pH为6.6) 、2.5mL 1%铁氰化钾溶液, 混匀, 50℃水浴锅中静止20min后冷却至室温, 加入10%TCA 2.5mL, 离心 (3000r/min, 10min) , 取2.5mL上清液加入0.5mL 0.1%三氯化铁溶液和2.5mL蒸馏水, 反应15min后, 于700nm处测吸光值。 1.2.5 氨基酸lma测定 氨基酸自动分析仪法, 参照GB/T 5009.124-2003。准确称取一定量酶解液 (使蛋白质含量在10~20mg范围内) , 加入15 mL 6 mol/L HCl, 抽真空充氮气, 封口后置于110℃恒温干燥箱水解22h, 取出冷却、过滤、定容至50mL, 吸取滤液1mL定容至5mL, 在40℃的真空干燥器中