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克氏原螯虾肺炎克雷伯菌的分离鉴定 肺炎克雷伯菌属于肠球菌科克雷伯菌科。这是一种常见的条件性感染。它也是重要的人类疾病。它可能会导致鱼、陆地动物和人类的许多感染疾病。 2019年5月湖北省潜江市一小龙虾养殖场发生了小龙虾“五月瘟”,导致了大量的小龙虾死亡。笔者通过对患病小龙虾的病原学检查发现其存在肺炎克雷伯菌感染的情况,进一步通过回归感染试验确定了该分离菌株对小龙虾的致病力。此外,通过药敏试验和最小抑菌浓度测定等方法研究了该分离菌株的敏感性,旨在为小龙虾“五月瘟”病原分析和疾病防控提供参考和依据。 1 材料和方法 1.1 菌株和试剂 患病小龙虾样品采集自湖北省潜江市某小龙虾养殖场;用于回归感染试验的健康小龙虾来自长江水产研究所荆州基地;抗生素标准品头孢拉定、氨曲南、氨苄西林、亚胺培南、头孢唑林、头孢吡肟、头孢噻肟、多粘菌素E、美罗培南、环丙沙星、阿莫西林、头孢他啶、氟苯尼考、四环素、苯唑西林、恩诺沙星、多西环素购自北京索莱宝科技有限公司;头孢唑肟、庆大霉素、阿奇霉素购自上海源叶生物科技有限公司;药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司;细菌基因组提取试剂盒、PCR Master Mix等分子生物学试剂购自TaKaRa公司;脑心浸液(BHI)培养基购自青岛海博生物有限公司。 1.2 肝胰腺的研磨 取濒死小龙虾在无菌条件下用生理盐水反复冲洗体表3～5次,在超净工作台中剖取小龙虾的肝胰腺,用生理盐水冲洗后采用匀浆器将其研磨均匀。取研磨液在脑心浸液(BHI)固体培养基上划线,将平板置于30 ℃培养16～20 h。从平板中挑取单菌落反复划线纯化2～3次,将得到的纯化菌株置于4 ℃保存,标记为 1.3 菌株生长培养 从纯化好的平板无菌挑取株的单菌落接种至BHI液体培养基中,30 ℃振荡培养至对数生长中期。培养好的菌液用麦氏比浊管稀释成1.5×10 1.4 形态特征观察 从纯化的平板上挑取株的单菌落进行革兰氏染色,在光学显微镜下观察细菌的形态特征。此外,将受试菌株的单菌落用无菌生理盐水重悬后加入到API20E生化鉴定试剂条上,按产品说明书操作,在28 ℃条件下培养24 h后将鉴定试剂条置于ATB 32GN细菌鉴定系统中进行生化鉴定。 1.5 细菌分子的鉴定 参照细菌基因组提取试剂盒操作说明书提取菌株全基因,以提取的全基因组作为模板,采用16S rRNA通用引物进行扩增 1.6 药物敏感测试 株对常用抗菌药物的敏感性通过纸片扩散法(K-B)进行测定 1.7 “mics”的测定 采用CLSI推荐的肉汤微量稀释法测定不同抗菌药物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations,MICs)。在96孔板中将配好的抗菌药物进行倍比稀释,每孔内药物体积为100 μL,然后加入100 μL稀释好的菌悬液,使每孔中菌悬液的浓度为5×10 2 结果与分析 2.1 剖检及细菌分离 发病小龙虾活力降低,应激能力差,采食量下降,进地笼后死亡的现象较多,其中大虾死亡情况较为严重。剖检发现其肝胰腺发白,肠道内容物较少,肝胰腺积水。采取患病虾的肝胰腺进行细菌分离,得到的优势菌在平板上形成半透明、颜色灰白、中央隆起的光滑菌落。经革兰氏染色镜检发现该菌为短杆状革兰氏阴性菌。 2.2 试验和分离试验结果 健康小龙虾注射不同剂量的悬液后出现了一定程度的发病和死亡,高浓度攻毒组出现了急性死亡现象,在3 d内全部死亡,而阴性对照组在试验期间没有明显的发病和死亡(表1)。感染后的小龙虾表现为活动减缓、无力等症状,剖检发现其肝胰腺发白,有部分出现积水现象。采用Bliss法得到了该菌株对小龙虾的LC 2.3 atb细菌鉴定结果 对分离纯化的优势菌接种于API20E生化鉴定条,经过孵育后置于ATB细菌自动鉴定系统中鉴定。结果发现该优势菌的生化特征符合肺炎克雷伯菌的特征,相似度大于98%。生化鉴定结果见表2。 2.41 系统发育树的构建 通过PCR扩增得到了分离株16S rRNA片段,长度约为1 500 bp,PCR产物经纯化后直接测序。将得到的序列(MT409892)与GenBank数据库中的已知基因序列同源性比对,构建系统发育树。结果发现,分离株肺炎克雷伯菌(KX237750.1、KU937377.1)、大肠杆菌(LR025099.1)、产气克雷伯菌(LR134254.1)聚为一支(图1),同源性为99%。结合该菌株的生理生化特征和系统发育树情况将该菌株判定为肺炎克雷伯菌。 2.5 抗菌药物敏感试验 通过K-B法测定20种化学抗菌药物的敏感性,其结果见表3。该菌株对头孢噻肟、多粘菌素B敏感,对新霉素、亚胺