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肝在实验性内毒素血症中的免疫调节作用 肿瘤坏死因子（tnf）是一个重要的因素。在动物体内，单个细胞主要受致病性微生物、寄生虫和毒素的刺激。它具有广泛多样的生物活性，不仅是免疫效应的材料，也是免疫调节的分子。一方面它可以直接杀伤肿瘤细胞,诱导某些病毒感染细胞的凋亡,另一方面可广泛激活机体免疫系统,诱导血管内皮细胞表达细胞间粘附分子-1(ICAM-1),增强组织MHC-Ⅰ类分子的表达,诱导肝脏急性期反应蛋白的合成。近年的研究表明,内毒素血症在肝硬化、急性肝衰竭等疾病的发生发展中发挥重要作用,其中由激活的枯否细胞分泌的TNF-α是一种重要的介质。为了探讨在内毒素血症,特别是肠源性内毒素血症中肝脏TNF-α的分泌特点,本研究在山羊采用慢性多血管插管的方法,经不同途径灌注细菌脂多糖,观测了TNF-α水平的动态变化。 材料和方法 1 实验动物 17只当地雄性去势山羊,购自江苏省溧水县农户,体重(16.75±1.79)kg,年龄1-2岁,自由饮水,饲以刈割的青干草。 2 术后全麻处理 所有的动物自购入后经1周以上的正常饲养。术前动物禁食24-36 h,右侧腹壁剪毛消毒,肌注氯胺酮(1 mg/kg)诱导麻醉,10 min后再肌注速眠新(解放军军需大学生产)0.5 mL进行全麻。左侧卧固定,首先装置颈静脉插管。右侧软腹壁采用普鲁卡因局部麻醉 ,手术开腹,顺序装置肝静脉和门静脉插管。各插管内充满1∶400的肝素钠灭菌生理盐水溶液。缝合创口。术后每日肌注青霉素160万单位,链霉素200 mg,并更换管内液体1次,连续4 d。术后第5d进行脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)灌注实验。 3 织物灌注前血样采集 LPS购自美国Sigma公司,提取自O55:B5型大肠杆菌。用前以灭菌生理盐水配制成两种浓度:① 2×104内毒素单位(EU)/L;② 3 mg/L,相当于1.5×106EU/L。 本试验分3组进行:组①经门静脉灌注低剂量LPS(20 EU/kg体重),共5例;组②经颈静脉灌注低剂量LPS(20 EU/kg体重),共5例;组③经颈静脉灌注高剂量LPS(1 500 EU/kg体重),共7例。 受试动物于灌注LPS前分别采集颈静脉、门静脉及肝静脉血,作为灌注前血样,LPS溶液预热到接近体温时进行灌注,保持缓慢而均匀的灌速,于15 min内灌完。灌注后1、2、3、5、8 h通过各血管插管采集颈静脉、门静脉和肝静脉血样,肝素抗凝,1 500 r/min离心15 min 分离血浆,-20 ℃保存待测。采样的同时还用直肠体温计测定了直肠温度,插入深度约8 cm。 4 中心操作要点中心 TNF-α水平的测定采用放射免疫分析法,试剂盒购自解放军总医院科技开发中心,批内误差为5%, 批间变异系数为8%,操作严格按说明书进行。采用Basic Statistics 5.0软件进行统计运算,统计数据以平均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,差异显著性检验采用t-检验法。 结果 1 灌注lps前后大鼠的服刑状况 在组①及组②,灌注LPS后动物的精神状态未见明显改变;但直肠温度有不同程度的变化;在组①,1 h时直肠温度出现上升趋势,变化幅度为0.61 ℃;在组②,1 h时直肠温度显著升高(P0.05),升高的幅度为1.02 ℃。在组③,灌注LPS后动物的精神状态有明显改变,表现为精神沉郁,食欲、饮欲消失,腹胀,4 h时精神状态恢复;直肠温度较灌注前有极显著的升高(P0.01),上升幅度为1.36 ℃。 2 血浆tnf-i水平动态变化 2.1 变化过程中的变化 图1显示组①颈静脉、门静脉及肝静脉血TNF-α水平的变化过程。结果表明,与灌注前相比,颈静脉、门静脉及肝静脉血TNF-α水平未出现显著变化(P0.05),仅肝静脉和门静脉血TNF-α水平在3-5 h出现上升趋势。 2.2 lps后zs-bs的变化 图2显示组②TNF-α水平的变化过程。灌注LPS后各静脉血出现不同程度的波动性变化(P0.05),其中颈静脉血在1 h出现上升趋势,门静脉血在0-8 h出现缓慢上升趋势。 2.3 灌注前后肝静脉血tnf-的变化 图3显示组③颈静脉、肝静脉和门静脉血TNF-α水平的变化过程。LPS灌注后1 h颈静脉、肝静脉及门静脉TNF-α水平均有迅速升高,并达到峰值,其值分别是(0.760±0.052)μg·L-1、(0.820±0.050)μg·L-1和(0.711±0.071)μg·L-1,较灌注前分别上升了0.311 μg·L-1、0.353 μg·L-1和0.260 μg·L-1, 以肝静脉血TNF-α上升幅度最高;1 h之后,各静脉血浆TNF-α水平迅速降低,至4 h降到接近灌注前的水平,4-8 h期间颈静脉及门静脉血中TNF-α的浓度继续下降而肝静脉血