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利用电化学方法测定原花青素的抗氧化力 葡萄籽提取物（opc）也被称为低聚原银草素。这是类黄酮类多酚化合物，可以溶解在水和酒精中，并与维生素c形成类似的活性，以调节人体毛细管的脆弱性和渗透性，保护心血管系统，清除自由基、肿瘤、防疫、肝脏等。在药品、保健食品和化妆品行业都得到了广泛的应用。对植物多酚的定量分析目前主要有重量法、容量法、分光光度法等,电化学分析法未见相关报道。本文采用线性扫描极谱法和循环伏安法研究了原花青素清除活性氧自由基能力与原花青素含量的线性关系,并对其反应机理进行了初步分析。 1 实验部分 1.1 工作电极和辅助电极 JP-303型示波极谱仪(成都仪器厂);PH-3B型精密pH计(上海精密科学仪器有限公司);三电极系统:滴汞电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极。 原花青素对照品(云南生物资源开发公司):按常规方法配制成1.00 mg/mL 邻苯三酚贮备液(AR):按常规方法配制成5.00 mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)(BR)- HCI缓冲溶液:0.50 mol/L (pH=8.33) 1.2 tis-hci法 于5 mL比色管中,加入适量浓度的原花青素贮备液, 0.5 ml 0.5 mol/L的Tris- HCI(pH=8.33)缓冲溶液,1.0 mL5.00 mmol/L邻苯三酚,定容刻度,摇匀。在1 min～6 min内,记录扫描电位在-0.8～-1.2V范围内-0.96±0.02V处的二阶导数极谱波。如图1。 2 结果与讨论 2.1 条件试验 2.1.1 不同ph值对稳定性的影响 邻苯三酚在Tris- HCI底液中可以发生自氧化反应,产生中间产物超氧阴离子自由基(O2·-),在单扫描示波极谱仪上于-0.68V、-0.96V、-1.4V(νs.SCE)处产生三个还原极谱波。其中自氧化中间产物不稳定, 在-0.96V处产生一随时间延长而逐渐增高而后又降低的灵敏极谱波。原花青素可以使该处峰电流减小。固定原花青素含量为20μg/ml,邻苯三酚的浓度为1.0 mmol/L,溶液pH=8.3,改变Tris- HCI缓冲溶液的浓度,测量其-0.96V峰极谱波的峰电流。结果表明,在0.1～0.2 mol/L范围内峰电流基本稳定。本实验选择0.1mol/L的Tris- HCI缓冲溶液为支持电解质。 以稀HCI和NaOH调节溶液的pH值,研究不同pH值下的Tris缓冲溶液中,邻苯三酚在加入原花青素前后-0.96V处极谱峰的电流之差。结果表明,邻苯三酚在碱性水溶液中自氧化速率随pH值增大明显加快,峰电流重现性受测定时间的影响不同。pH6的酸性介质中重现性好,但峰电流较小,灵敏度较差;pH9的碱性介质中灵敏性较好,但测量时间不易控制。本实验选择Tris缓冲溶液为pH=8.3,在极谱峰线性增长范围内记录其自氧化4 min时的峰高。 2.1.3 邻苯三酚峰电流的测定 在上述条件下,固定原花青素含量为20 μg/mL,逐渐增大邻苯三酚的浓度,测量其-0.96V峰处峰电流。结果表明,在1.0～2.0 mmol/L范围内,峰电流基本保持不变。本实验选择邻苯三酚的浓度为1.0 mmol/L。 2.2 线性方程的确定 原花青素使邻苯三酚在(-0.96±0.02)V处的二阶导数极谱波峰电流减小,原花青素加入前后极谱波峰电流 IP1、IP2之差△IP(nA)与原花青素的含量ρ(μg/mL)在10～100 μg/mL之间有良好的线性关系。即△IP= Kρ,线性方程为△IP= 2.55 ρ +44.33(r=0.997 4)。检出限为4 μg/mL。 2.3 原花青素含量的测定 称量葡萄籽提取物干燥粉碎样品0.211 0 g,加入少量水溶解,定容于100 mL容量瓶中,静置后,取其清液1mL按1.2项下实验方法进行测定,由校准曲线求出原花青素的含量,并用标准加入法进行回收试验。结果见表1。 2.4 葡萄籽原花青素的ic50 以抑制百分率为50%时的相应浓度(IC50)来表示样品的抗超氧阴离子自由基的能力。 由线性方程可求出葡萄籽原花青素的IC50值为14.8 μmol/L。与黄酮类化合物槲皮素、芦丁相比,在相同试验条件下,其IC50值分别为16.3 μmol/L和17.8 μmol/L。表明葡萄籽原花青素具有较强的清除活性氧自由基的能力。 2.5 研究极谱波性质 2.5.1 循环伏安扫描结果 在选定的实验条件下,对Tris-原花青素-邻苯三酚体系,在-0.8～-1.1V范围内进行循环伏安扫描,见图2。阴极扫描-0.96V处出现一还原波,回扫时没有对应的氧化波。说明为不可逆还原过程。 2.5.2 扫描速率的影响 在实验条件下,在100～1000 mv/s范围内改变扫描速率ν,测定络合物波的峰电流IP和峰电位VP。ν