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大白菜叶片叶绿素提取及稳定性研究 叶色是植物叶片的主要色素，叶色含量是植物生理研究的重要指标。生产中也往往根据叶色变化作为看苗诊断和采取施肥措施的重要指标。叶绿素含量测定方法主要有分光光度计法、活体叶绿素仪法和光声光谱法。但用手持叶绿素仪或光谱分析仪测得的是色素相对含量指标, 并且不同种类植物叶片中的色素指标与实际叶绿素含量之间的关系方程式不同, 即不能用同一种色素指标关系来转换不同植物的色素含量。在日常试验中以分光光度计法应用最为广泛。另外, 根据所用提取溶剂不同又有多种测定方法, 早期叶绿素测定广泛采用Arnon法。但该方法由于需要先研磨后除渣, 工作量大、步骤多且易受光氧化而引起偏差, 不适宜田间大量样品的提取和测定。张宪政提出了丙酮、乙醇混合液法浸提叶绿素, 证明利用混合液进行叶绿素浸提的可行性;洪法水等发现, 丙酮与乙醇混合液提取叶绿素存在协同效应, 且二者在等摩尔混合时提取效果最好;徐芬芬等研究认为, 丙酮与乙醇体积比1∶1混合液浸提白菜叶绿素效果最好;而麻明友等发现, 丙酮与乙醇体积比2∶1的混合液浸提猕猴桃叶片叶绿素效果较好。 白菜 (Brassica campestris ssp.chinensis Makino) 别称不结球白菜、青菜、油菜等, 是原产于我国的、重要的叶菜类作物, 在长江中下游及以南广泛栽培, 可周年生产, 具有极大的经济价值。叶绿素是叶菜类作物重要生长指标, 准确地测定其含量可为叶菜类生长发育以及逆境胁迫等试验提供基础。为了探讨实现白菜叶片叶绿素提取并能尽量避免光分解, 建立适合大量样品的叶绿素提取及其含量测定方法的可能性和科学性, 本试验以苏州青、华王2个白菜品种为试材, 就不同比例的丙酮与乙醇混合溶液提取测定白菜叶片中叶绿素含量及其稳定性进行比较分析, 为白菜田间大样本叶绿素含量测定提供依据。 1 材料和方法 1.1 小丝液的制备 2个白菜品种为苏州青和华王。将新鲜白菜叶片洗净, 用吸水纸吸干表面水分, 去除大叶脉后, 将叶片剪碎成约0.2 cm×1.0 cm的小细丝, 混匀备用。 1.2 仪器和试剂 试验用752s紫外可见分光光度计测定吸光度。丙酮、乙醇等试剂均为分析纯, 试验用水为超纯水。 1.3 测试方法 1.3.1 叶绿素提取方法 按体积比配制浸提液, 设6个处理:处理1, 95%乙醇;处理2, 80%丙酮;处理3, 乙醇∶丙酮=1∶1;处理4, 乙醇∶丙酮=2∶1;处理5, 乙醇∶丙酮=1∶2;处理6, 乙醇∶丙酮∶水=4.5∶4.5∶1。用6个提取液提取叶绿素, 3次重复。浸提均在黑暗中进行, 每支试管加入浸提液20 m L, 并不时摇动, 待叶片变白后测定其吸光度。样品分别于645、663 nm波长下测定吸光度, 由Arnon法进行修正, 公式为: 式中:D663 nm、D645 nm分别为相应波长下的吸光度;V为提取液体积 (m L) ;m为所取叶片质量 (g) , Ca、Cb、Ca+b的单位为mg/g。 1.3.2 不同提取液对叶绿素稳定性的影响 室温条件下, 用不同浸提液浸提白菜叶片叶绿素, 待叶片变白后, 分别放置24、48、72 h后再次测定提取液中叶绿素含量, 比较叶绿素在不同提取液中的稳定性。 2 结果与分析 2.1 不同处理对b、叶绿素总量的影响 表1显示, 在浸提48 h后, 不同处理对2种白菜叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量的提取效果存在较大差异。处理3与处理5间叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量差异不显著, 且提取总叶绿素含量较高, 苏州青分别为1.956、1.935 mg/g, 华王分别为2.532、2.571 mg/g。而处理1、处理2浸提得到的叶绿素总含量均较低, 苏州青分别为1.550、1.551 mg/g, 华王分别为2.014、2.079 mg/g。 由表1还可以看出, 单一溶剂提取效果均不如混合液浸提效果好。这可能是因为乙醇和丙酮间存在协同萃取效应, 促进了叶绿素的快速提取。 2.2 不同处理种叶片叶绿素含量的变化 用不同浸提溶剂提取白菜叶片叶绿素含量, 其稳定性结果见表2、表3。从表2、表3可以看出, 2种白菜的叶绿素a和总叶绿素含量均在第2天达到最大值。处理3、处理4、处理5中叶绿素b含量均在第3天达最大, 但与第2天结果相差不大。苏州青叶绿素含量的测定结果显示, 第3天叶绿素a含量比第2天低17.3%~22.2%, 致使总叶绿素含量均在第3天下降, 说明叶绿素a相对容易降解。同时, 试验也表明叶绿素提取液不适宜长时间放置。 3 浸提法水及乙醇与丙酮的配比对叶绿素提取效果的影响 室温下, 采用不同比例的丙酮、乙醇混合溶剂提取小白菜叶片中叶绿素。试验结果表明, 混合液提取法所得叶绿素含量高于单一溶液提取, 其中以混合液V乙醇∶V丙酮=1∶