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解钾菌k03的分离鉴定及其在烤烟生产中的应用 钾是烟草生长所必需的重要因素之一，它可以改善烟草叶的吞咽性，改善烟草叶的口感、味道和质量。我国烟叶钾的含量普遍偏低, 与我国土壤钾含量普遍不足有关。增施K肥和提高土壤中K的有效性是提高烟叶K含量的有效途径。然而, 我国K肥资源较为匮乏, 而且单纯增施K肥并不能提高烟叶中的K含量。因此, 适当减少K肥用量, 提高土壤K的有效性, 将是我国烤烟乃至农业高效可持续发展的根本措施。 解钾菌又称硅酸盐细菌, 作为PGPR的重要类群, 施入土壤中能够释放钾元素, 同时还能活化其他土壤养分, 挖掘土壤潜在肥力, 促进作物生长, 提高农作物品质。解钾菌肥在小麦、玉米等农作物上使用都取得了良好的效果, 在烤烟上的应用报道尚不多见。本研究将分离自湖北神农架烟区烤烟根际的解钾菌K03, 进行菌种鉴定, 制成菌肥, 应用于烤烟大田生产, 以期能活化土壤养分, 为改善烤烟生产提供试验依据。 1 材料和方法 1.1 病毒 解钾菌K03, 分离自环神农架烟区烤烟根际土壤, 由河南农业大学生命科学学院微生物中心保藏、提供。 1.2 解钾菌的鉴定 1.2.1 革兰氏染色观察 将菌株划线分离, 形成单菌落。接种于LB中37℃ 220 r·min-1培养16～18 h, 于对数生长期进行革兰氏染色观察。接种于硅酸盐细菌培养基培养, 28℃培养7 d, 观察菌落形态。 1.2.2 生理生化的评价 生理生化鉴定采用VITEK系统 (法国生物梅里埃biosMerieumx公司) , 按其说明书的方法进行。 1.2.3 srdna的构建 按Weisburg等的方法。收集LB培养液中培养的菌体, 采用CTAB法提取细菌的总DNA。利用16S rDNA通用引物进行PCR, 通用引物的序列是5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′ 和5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系是10×PCR Buffer 5 μL, dNTP (2.5 mmol·L-1) 4 μL, DNA模板 1 μL, 上游引物 (20 μmol·L-1) 1 μL, 下游引物 (20 μmol·L-1) 1 μL,Taq酶 (1 U) 0.5 μL, ddH2O定容至 50 μL。PCR产物纯化后和T载体连接, 转化大肠杆菌, 从转化子中提取重组质粒, 送郑州博兴生物技术公司进行测序, 得到16S rDNA部分序列。将测序结果输入GenBank, 利用BLAST软件, 将测定得到的基因序列与GenBank数据库中的序列进行同源性分析, 获取同源性较高的相邻的种、属的16S rDNA序列, 使用CLUSTALX 1.8和 TREECONW 1.3软件构建系统发育树。 1.3 草炭的制备 参考吴风光等的方法。将解钾菌K03接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中, 28℃, 160 r·min-1摇瓶培养至对数生长末期, 和适量草炭混合制成。经28℃培养5 d, 使细菌进一步繁殖后, 用硅酸盐细菌培养基进行平板稀释计数, 每克菌肥含活菌数不低于 1 亿个为合格。 1.4 对土壤有机碳的初步形成和应用 试验在湖北省房县湖北中烟工业有限责任公司实验基地进行, 每个小区面积为 39.6 m2。施用解钾菌肥处理, 菌肥用量30 kg·hm-2, K 肥施用量是常规施肥的80% (B+80% K) ;另一处理是常规施肥处理作为对照 (100% K) 。每个处理重复 3 次, 按随机区组排列。移栽前土壤理化性质分析结果见文献。烤烟品种为‘云烟87’, 由湖北烟草科研所提供。分别于团棵期、旺长期、现蕾期和圆顶期进行烤烟农艺性状情况调查, 取烤烟根际土壤测定微生物数量, 对圆顶期土壤进行全面理化性质分析。取样均采用5点取样法。 1.5 培养基的制备 细菌计数采用牛肉膏蛋白胨培养基, 放线菌计数采用改良高氏一号培养基, 真菌计数采用马丁氏 (Martin) 培养基, 解钾菌计数采用硅酸盐细菌培养基。 1.6 土壤化学成分的测定 土壤中 P, K, Ca, Mg, Cu, Zn, Fe 和 Mn 全量和有效态含量的测定, 采用常规方法。 1.7 数据分析 利用统计软件DPS 进行数据分析。 2 结果与分析 2.1 确定细菌和肥料的来源 2.1.1 细胞圆形 解钾菌K03是无芽孢的革兰氏阴性菌, 细胞椭圆形, 直径近0.53 μm。在硅酸盐细菌培养基平板上菌落不规则, 无色, 呈现典型的光滑、油滴状。 2.1.2 结果表1 采用VITEK鉴定系统GNI+鉴定卡, 鉴定结果见表1。从仪器返回的生理生化反应结果可知, 解钾菌K03与肠杆菌属的阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae) 相似。 2.1.3 srda序列及系统发育树分析 测序得到16S