赤藓糖醇高产菌选育及发酵条件研究.docxVIP

? ? 赤藓糖醇高产菌选育及发酵条件研究 ? ? 温拥军，游玟娟，罗跃中，谢达平 （1.湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004； 2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128） 赤藓糖醇高产菌选育及发酵条件研究 温拥军1，2，游玟娟1，罗跃中1，谢达平2 （1.湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004； 2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128） 为了提高赤藓糖醇的产量，对自选耐高渗酵母菌T-3-2进行紫外线与亚硝酸复合诱变处理，并采用响应曲面法优化了其发酵条件。复合诱变得到1株稳定高产突变株UN-11，其赤藓糖醇的产量达到78.3mg/mL，比T-3-2提高了38.8%；通过响应面分析建立了关键影响赤藓糖醇产量的二次多项式数学模型，得到最佳生产工艺条件为：发酵温度31℃、转速170r/min、接种量9.8%。模型预测结果产物浓度达到84.93mg/mL，验证实验结果产物浓度为85.25mg/mL。该模型对赤藓糖醇工业化生产有一定的指导意义。 赤藓糖醇，耐高渗酵母，紫外线，复合诱变，响应曲面法 赤藓糖醇是一种国际上较为流行的新型甜味剂，它主要存在于藻类、蘑菇等真菌类生物，甜瓜、葡萄等水果以及葡萄酒、酱油等各类发酵食品中，同时它在人体的血液、精液、尿液中也有一定的含量[1-3]。其具有低热值、口感好、低吸湿性、无致龋齿性、不易出现变褐现象等优点[4-6]。因此在食品工业，医药保健及化妆品等行业均有广阔的应用前景[7]，但长期以来赤藓糖醇行业受困于成本高、价格昂贵，严重限制其应用范围。目前，赤藓糖醇的工业化生产唯一方法是微生物发酵法，在微生物发酵生产中影响产物产量的主要因素是菌种和发酵条件。近年来，国内外学者对此进行了大量研究，刘鹏等[8]筛选得到一株赤藓糖醇产生菌E54，其产量为41.1g/L；刘凤珠等[9]通过紫外诱变获得一株产赤藓糖突变C1，其产量为24.9g/L；董海洲等[10]对Torulopsis sp.ERY237发酵条件进行优化，在最佳条件下赤藓糖醇产量可达87.8g/L。总的来说，我国对赤藓糖醇生产的研究系统化程度低，产量不高，工业化进程较慢。如何进一步提高菌种性能，优化发酵条件，提高赤藓糖醇产量，将是今后研究的重点。本研究以自选耐高渗酵母（osmotolerant yeast T-3-2）为出发菌株，经紫外线与亚硝酸复合诱变，得到一株稳定高产突变株UN-11，通过对发酵条件进行优化，使赤藓糖醇的产量大幅度提高，旨在通过降低生产成本，提高其市场竞争力，扩大其应用范围。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 耐高渗酵母（osmotolerant yeast T-3-2） 由本实验组从蜂巢中分离得到；斜面培养基 PDA培养基；固体平板培养基 葡萄糖50%，酵母膏0.5%，琼脂2%，pH6.0；发酵培养基 葡萄糖30%，玉米浆0.8%，CuSO4·5H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.5%，pH自然。 HPS-250生化培养箱 哈尔滨东明医疗仪器厂；CBV-1500A超净工作台 上海瑞仰净化装备有限公司；QYC.2102摇床 上海福玛实验设备有限公司，LDZ4-0.8A离心机 北京医用离心机厂；HH.SYHNi2-C水浴锅 北京长源实验设备厂；UV-9100紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司。 1.2 实验方法 1.2.1 紫外及亚硝酸诱变方法 参照游玟娟等[11]实验方法进行，诱变菌株经培养后，挑取菌落较大且厚的菌株，编号并接入试管斜面保藏，同时取对应的菌株接种到250m L摇瓶（装液量为50m L）中，置于30℃，180r/m in摇床培养5d，测定发酵液的赤藓糖醇含量。 1.2.2 发酵条件优化方法 采用单因素实验，分别研究发酵温度、发酵时间、摇床转速、接种量、装液量及起始pH对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响。在此基础上，运用Box-Behnken设计进行响应曲面优化，找到最佳发酵条件。BBD实验设计的因素及水平如表1所示。 表1 BBD响应面设计的因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design 1.2.3 赤藓糖醇测定方法 采用袁野等[12]高碘酸氧化法测定。 2 结果与分析 2.1 紫外线诱变筛选结果 紫外线诱变得到结果如表2所示。由表2可知，经过紫外线诱变后，部分菌株赤藓糖醇产量下降，如UV-2、UV-6、UV-16、UV-20等，同时也发现大部分菌株的赤藓糖醇产量都有所提升，如UV-9、UV-11、UV-13、UV-14、UV-17、UV-19菌株产量都达到了60mg/m L以上，其中UV-13菌株赤藓糖醇产量最高，达到68.4mg/m L。相对于出发菌株T-3-2，UV-13产赤藓糖