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荧光原位杂交技术原理及应用 基于传统的核电站原始杂交技术，提出了这种非辐射原位杂交技术。其基本原理是用已知的标记单链核酸为探针, 按照碱基互补的原则, 与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合, 形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列, 因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因定位在染色体上。与传统的放射性标记原位杂交相比, 荧光原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点, 不但能显示中期分裂相, 还能显示间期核。 1 原聚光灯技术 1.1 检测类型 1.1.1 基因组的选择 人类和哺乳类基因组内都有一些高频率的重复序列, 在进化上很少具有保守性, 如果以基因组为探针, 这些存在于靶序列和探针之间的高度重复序列会首先退火, 超过那些单一和保守的序列, 因而杂交表现出种的特异性。 1.1.2 靶位点与杂交信号相结合 类似于a卫星、卫星III类的探针杂交靶位点常常大于1 Mb, 与靶位点结合紧密, 杂交信号强, 易于检测, 常用于检测间期细胞非整倍和微小标志染色体。 1.1.3 探针的制备 由一条染色体或其上某一区域极端不同核酸片段组成, 可由克隆到噬菌体或粘质粒的染色体特征性大片段插入文库制取, 切微切文库探针片段小, 与邻近区域发生重叠或制片中被破坏的可能性小。可用于中期染色体重组和间期核结构分析。 1.1.4 隆载体与探针的药物检测 对于存在于基因组内的单一序列基因, 检出的最好方法是使用含有插入片段的较大的克隆载体, 如Cosmids可载40 kb的插入片段, YAC载体能载100~800 kb左右的片段。但有研究报道:小到2 kb的质粒探针仍可用FISH检测, 只是效率很低。主要进行染色体克隆DNA定位和检测靶细胞序列拷贝数和结构变化。 1.1.5 寡聚核苷酸rna探针和探针的制备方法 RNA探针包括ss RNA和寡核苷酸RNA探针两种, 其中单链反义RNA探针广泛用于组织切片和整体制备物上。寡聚核苷酸RNA探针与目标形成的杂交体比DNA探针更紧密, 同时它可用来鉴别一些特定序列如2个相关密切的同源性m RNA。而且寡聚核酸RNA探针长度短小, 具有超强的穿透性进入细胞核和组织切片。 2 h再向fibur? 在20世纪90年代, FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber!FISH的发展趋势, 灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。在荧光原位杂交基础上又发展了多色荧光原位杂交技术、染色质纤维荧光原位杂交技术、组织微阵排列技术等。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 1.2 探针标记标记 探针的标记有2种:第1种直接标记法是将荧光分子直接掺入到探针分子中。这种方法快速简洁, 结果背景干扰少, 但杂交信号弱, 而且不能进一步放大。第2种间接标记法是将一些类似于半抗原 (hapten) 的标记分子掺入探针分子中。目前采用的中间分子有:生物素、地高辛配基、2!乙酰氨基芴、汞分子和硫化基团。目前前2者以标记核苷酸类似物的形式被掺入探针的, 因此可以采用常规的缺口平移法、随机引物法、PCR或RNA体外转录法进行标记, 故最为常用。探针标记通常有2个目的:一方面将标记好的核苷酸加入到探针序列中去, 另一方面可以将DNA片段长度缩小到500 bp以下。长的探针会导致明显的背景着色。当用短的探针时可以通过降低甲醛的浓度, 增加SSC的浓度, 或者降低洗涤温度来调整杂交和洗涤条件。探针长度缩短时, 相应的洗涤时间也要缩短。 1.3 荧光标记检测 最佳杂交条件取决于探针和目标的性质。已标记好的变性的探针 (200~500 bp) 与变性的染色体在37℃、50%的甲酰胺2×ssc条件下进行杂交过夜, 接着是柔和的洗涤以去除未杂交或配错对的探针, 然后用荧光标记的检测试剂检测常用于标记的荧光分子及其特征如表1。对于单拷贝基因的杂交, 特别是较长的来自基因组的序列, 一般在杂交以前进行预复性过程, 标记的探针与过量的基因组DNA或Cot!1重复序列一起孕育1 h, 是探针中非特异的重复序列被封闭, 从而抑制该部分探针与染色体间发生的非特异性杂交。经预复性之后的探针再与变性的染色体标本杂交过夜。 1.4 般显带的处理 先进行染色体显带, 然后再进行FISH, 会明显降低杂交信号的检出率, 因此, 一般显带是在杂交以后。常用的方法有Actinomycin/DAPI显示的G带, 经溴尿嘧啶处理后Hoechest染色显示的R带等等。采用Alu或ine重复序列与探针同时进行杂交, 亦可得出R带或G带的效果。 1.5 照片