荧光原位杂交技术在基因鉴定中的应用.docxVIP

荧光原位杂交技术在基因鉴定中的应用 dap是2世纪8年代初在原含辐射原交技术的基础上发展起来的一种非辐射原交技术。bauman在荧光后标记rna，作为研究数据进行注入。其基本原理是用已知的标记单链核酸为探针, 按照碱基互补的原则, 与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合, 形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列, 因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因定位在染色体上。与传统的放射性标记原位杂交相比, 荧光原位杂交具有安全、快速、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点, 不但能显示中期分裂相, 还能显示间期核。 1 分子杂交和非放射性标记检测 荧光原位杂交技术是在同位素原位杂交技术的基础上发展起来的.1969年Gall和Pardue及John等分别独立建立了同位素原位杂交技术。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来, 提高了基因定位的准确性。1975年, Manning等人最先在溶液的分子杂交中, 使用非放射性标记, 通过细胞色素C将生物素与RNA分子连接起来。1977年Rudkin等发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交技术。1981年Roumam首次报道了荧光素标记的cDNA作原位杂交。同年, Langer等用生物素标记核苷酸制备探针。1986年, Cremer与Lieher等分别证实了荧光原位杂交 (FISH) 技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性, 从而开辟了间期细胞遗传学研究。 2 中期染色体fish的再向fiber-fish的发展趋势 在20世纪90年代, FISH在方法上逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向fiber-FISH的发展趋势, 灵敏度和分辨率也有了大幅度的提高。以下简单介绍近年来FISH技术的发展。 2.1 sh的染色体特征 是用全染色体或区域特异性探针, 通过多彩色FISH使中期细胞特异染色体和间期核呈现不同荧光颜色的条带, 从而分析染色体的方法, 常用于识别染色体重组、断裂点分布、鉴别染色体外核物质的起源。 2.2 间接标记检测 是用寡核苷酸作为引物, 原位PCR扩增待测序列, 并在此过程中掺入荧光素直接或间接标记的核苷三磷酸, 使扩增出的序列都得以标记。通过几轮这样的扩增, 使待检的几个序列的原位扩增产物标记上不同荧光素, 实现同时对多个微小缺失和突变等染色体微小改变的检测。这方法已常规用于检测特异性a卫星序列在染色体和间期核内的定位。 2.3 检测正常中期染色体的强度 是在荧光原位杂交基础上结合消减杂交技术于9O年代发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术, CGH以不同荧光标记待测和参照细胞群的等量基因组DNA, 并用加入一定量的人竞争DNA ( Cot-1 DNA) 抑制分散重复序列 (interspersed repetitive sequence, IRS) 。不同标记的DNA同时与正常中期染色体杂交, 结果正常染色体每个位点上的两种荧光强度之比反映待测与参照基因组DNA序列的拷贝数之比。这个方法最大的优点是:在一个实验中完成一个样本全部染色体丢失和获得的检测, 并且不需要分裂细胞。主要的缺点是分辨率不高, 可以检出的缺失大小约5~10 Mb;另外, 不能检测出没有基因组拷贝数明显变化的染色体平衡易位、倒位及全基因组的整倍体改变。与FISH相比, CGH在一次实验中能对肿瘤样品中整个基因组中的DNA扩增和缺失等变异获得整体认识, 并描绘出相应的CGH核型图, 可在物种间进行染色体同源性比较, 从而弥补了常规FISH只适于小部分肿瘤的不足。 2.4 用流变剂进行染色加工 游离染色质丝尽管已经失去了原有的细胞空间结构。但它仍是DNA和蛋白质的复合大分子。其染色质的基本结构核小体和组蛋白并没有遭到破坏.在Heng等人的思路的基础上, Wiegant、Parra和Windle进一步想到用更强的变性剂对染色质丝进行处理。让DNA分子完全从蛋白质中分离出来, 制备出DNA纤维。Wiegant等用一种含高浓度盐和一定量的变性剂的碱性缓冲液对间期细胞核进行处理后.得到一种被称为Halo的DNA纤维结构围绕在细胞核周围.这是一些环状DNA分子片段.通常有400~500kb长, 可以用来作为高分辨率的FISH的靶DNA, 就是最初的纤维-FISH。纤维-FISH具有高分辨率, 能进行定量分析, 模板要不高, 只需分析少量的DNA分子, 灵敏度高等优点。由于纤维-FISH的这些优点, 使得它在染色体图谱绘制, 基因重组研究以及临床染色体基因序列检测工作中起着十分重要的作用。 2.5 荧光免疫核型分析和间期细胞遗传 ring-FISH它利用多聚核苷酸探针, 第一