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荧光原位杂交的新技术及其检测应用 分子遗传的发展为对宏观细胞学和微观生物学的研究架起了一座桥梁。早期细胞遗传学的研究是建立在细胞核和染色体基本特征上的, 如染色体的长短、臂比、着丝粒、端粒、核仁组织区等, 荧光原位杂交技术 ( fluorescence in situ hybridization, FISH) 的出现标志着分子细胞遗传学一个重要阶段的开始。近年来, 随着物理、化学技术的发展与进步, 免疫染色、量子点和微流控芯片等不断被引入到荧光原位杂交中, 促进了荧光原位杂交技术和分子细胞遗传学的发展。 1 原聚光灯技术 1.1 荧光原位杂交 荧光原位杂交技术是根据核酸碱基互补配对原理, 用半抗原标记DNA或者RNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对, 通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测, 或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合, 最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况。FISH技术发展早期, 是应用放射性同位素标记探针来定位目标序列的, 直到1980 年Bauman等才将荧光染料直接标记RNA探针的3’端, 并检测到了特异的DNA; 1982年Manuelidis等采用生物素标记的探针进行了染色体原位杂交。然而由于植物细胞中细胞壁的存在, 非放射性生物素标记探针技术直到1985 年才首次应用于黑麦中120 bp重复序列在小麦染色体上的分布研究。因荧光原位杂交技术克服了放射性探针检测周期长且危害人体健康的缺点, 被广泛应用于基因定位、染色体识别、物理图谱的构建、进化分析等研究中。FISH技术常用的半抗原标记物有生物素和地高辛, 检测的荧光基团有异硫氰酸荧光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC) 、花菁染料 ( cyaninedye) 和罗丹明 ( rhodamine) 等。 1.2 间期细胞核的检测 衡量FISH技术两个最重要的参数是分辨率和灵敏度。FISH技术从诞生发展至今已有30 多年的历史, 期间主要是通过改良靶标序列和探针种类来不断提高其分辨率和灵敏度的。荧光原位杂交是在染色体、间期细胞核和DNA纤维上进行DNA序列定位的一种有效手段, 研究中涉及较多的是有丝分裂中期的染色体。这一时期的染色体形态较好, 制片技术简单, 但其分辨率较低 ( 如分辨率水平在人类中期染色体上只有1 ~ 3 Mb) , 难以进行精细的物理图谱构建, 而且对于较小的染色体也无法识别; 减数分裂期的染色体浓缩程度大大降低, 比中期染色体长10 ~ 20 倍, 可提高杂交分辨率。番茄粗线期染色体上的FISH结果证明其分辨率可达到 100 kb的水平, 适于定位低单拷贝DNA序列以及遗传图谱和物理图谱的整合, 但减数分裂期的染色体取材较难, 制片技术也不太好掌握;间期细胞核比较容易获得, 染色质浓缩程度也低于中期染色体, 可在两个相距50 kb左右的DNA序列间检测到信号分离。但由于缺乏可辨别的染色体形态结构, 间期细胞核上的FISH无法识别不同的染色体; DNA纤维 ( fiber) -FISH的成功应用突破了分辨率的限制, 它人为的改变了染色质原本的空间结构, 通过裂解间期细胞核释放出染色质纤维, 去除了组蛋白等蛋白质的束缚使DNA得到伸展, 其分辨率可达到1 ~ 500 kb。但DNA纤维 ( fiber) -FISH技术需要两个探针进行共同定位才能鉴别染色体, 而且DNA纤维伸展程度不一以及随机断裂将会导致信号的长度不一。荧光原位杂交技术的探针包括重复序列、基因组序列、低单拷贝序列和大片段克隆 ( BAC、YAC和MAC等) , 其中BAC-FISH可以有效的进行低单拷贝DNA序列定位作图, 还可进行遗传图谱的绘制、染色体识别等。但由于这些大片段的克隆往往含有重复序列, 导致非特异性杂交信号的产生, 需进一步通过序列比对将重复序列去除。 随着FISH技术的不断完善与发展, 已被广泛应用于DNA序列或基因的定位、核型分析、基因组进化研究、物理图谱的构建、转基因生物的鉴定等。在FISH基础上发展起来的多色荧光原位杂交 ( multiplex-FISH, M-FISH) , 可通过多色荧光同时探测多个目标, 如用不同颜色的探针组合来识别人类的24 条染色体。继而在M-FISH的基础上又发展了比较基因组原位杂交 ( comparative genomic hybridization, CGH) 和三维荧光原位杂交 ( threedimensional FISH, 3D-FISH ) 技术。比较基因组原位杂交将供试材料和对照组材料的DNA用不同颜色的荧光基团进行标记, 同时在对照组的染色体上进行杂交, 根据产生颜色的差异来判断两个基因组相对DNA拷贝数的变化,