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蛋白酶k的功能和应用 丝氨酸酶是一个重要的蛋白水解酶，以丝氨酸为中心，对生物水体具有重要而广泛的生理作用。它们通过激活或抑制酶原，起到调节因素的作用。本文研究的蛋白酶K属丝氨酸蛋白酶类,它是林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Kerantin)为唯一碳氮源的环境中生长,故将其称作蛋白酶K。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性,能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键,常被用于降解蛋白生产短肽。它具有丝氨酸蛋白酶类所具有的典型催化三联体Asp39-His69-Ser224特征并且活性中心周围有两个Ca2+结合位点以增加其稳定性,使其在更广泛的条件下保持较高的酶活力。蛋白酶K能将蛋白失活或降解,利用其这个特性,在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K都有着重要的应用。因此,研究和探索蛋白酶K的性质、功能以及应用,对其发展现状进行展望是进一步开发利用这种高效酶的前提,本文重点对蛋白酶K的结构、性质以及应用进行了研究。 1 酶k的分子特征、酶学特性和分子发育 1.1 k抑制剂k基因表达 源自林伯氏白色念球菌的蛋白酶K酶原的基因由两个外显子编码,包括15aa的信号肽,90aa的前导肽和279aa的蛋白酶K成熟肽。长度为63bp的内含子位于前导肽序列区,前导肽在蛋白酶K酶原经转录翻译后在内质网处被切下,从而释放出蛋白酶K成熟肽。研究发现蛋白酶K含有丝氨酸蛋白酶类所具有的典型催化三联体Asp39-His69-Ser224特征(图1),且蛋白酶K的多肽链序列和三维空间结构与枯草杆菌蛋白酶有着高度的同源性,所以蛋白酶K也被归为枯草杆菌蛋白酶家族类。 蛋白酶K蛋白中含有两个Ca2+结合位点,它们离酶的活性中心有一定距离。研究发现如果用EDTA除去Ca2+,催化活性将在6h内丧失80%左右,这可能是由于Ca2+的丢失会引起活性中心远端蛋白构象的变化,若再加入Ca2+则其活性又会恢复至28%左右,却不会完全恢复。蛋白酶K除含有两个Ca2+结合位点有助于稳定蛋白构象外,蛋白内还有两对二硫键,因此蛋白酶K比其他枯草杆菌蛋白酶在极端p H和高温等环境中有更高的稳定性。 1.2 蛋白酶k活性的变化 最初通过凝胶过滤实验推测蛋白酶K分子质量大约为18,500,之后经SDS凝胶电泳进一步精确其摩尔质量为27,000U。1986年Jany K D等确定了蛋白酶K的基因序列而给出了准确的摩尔质量值是28,930U。目前主要有两种蛋白酶K的酶活测定方法。第一种是福林-酚试剂法,通常以酪蛋白或变性血红蛋白为底物,测定在一定p H和温度条件下酶解产生酪氨酸的量。第二种方法是以Suc-(Ala)3-NH-Np或Suc-(Ala)2-Pro-Phe-p NA等试剂为底物,在一定温度下反应后用冰醋酸终止反应,410nm测吸光值确定酶解反应释放的硝基苯胺的量,从而可避免福林-酚试剂法样品中含有酚类、柠檬酸和巯基化合物等杂质带来的干扰作用。通过测定蛋白酶K在不同p H条件下水解经尿素变性的降解血红蛋白的活性,显示蛋白酶K在p H7.5~12.0之间都具有较高的酶活。目前蛋白酶K通常使用的p H范围是7.5~9.0。研究显示37℃时蛋白酶K的活性最高,在20~60℃之间蛋白酶K的酶活都可保持在80%以上。 源自林伯氏白色念球菌的蛋白酶K比活力是所知的肽链内切酶中最高的。在没有Ca2+的条件下蛋白酶K的剩余活性通常就足以满足降解蛋白质的应用要求,如在纯化核酸的过程中,通常需加入EDTA螯合Mg2+以消除核酸酶的降解作用,但失去Ca2+的蛋白酶K活性仍可满足要求。但在消化如角蛋白一类对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白时,则需要在反应液中添加1mmol/L Ca2+。除Ca2+离子会影响外,蛋白酶K的酶活还会被DFP、PMSF等抑制,但是却不会被胰蛋白类丝氨酸蛋白酶抑制剂(TLCK)、糜蛋白类丝氨酸蛋白酶抑制剂(Tos-Lys-CH2Cl)或巯基试剂等抑制。除此之外,蛋白酶K在0.5%SDS和1%(w/v)Triton X-100中也能较好地保持活力。 1.3 突变位点筛选和活性提高 通过分子定向进化提高酶的活性是现代生物技术常用的手段之一。对于蛋白酶K这类缺乏有效高通量筛选策略的对象而言,利用易错PCR或基因重排等技术产生的突变库容量巨大,很难从中快速筛选到活性有所提高的突变子。Jun Liao等采用基于结构比较的分子进化策略,从和蛋白酶K分子同源性较高的蛋白分子中选取了24个突变位点(N95C,P97S,E138A,M145F,L299C,I310K,P265S,P355S,S107D;S123A,I132V,L180I,R237N,S273T,G2