荧光原位杂交技术在细胞遗传学中的应用.docxVIP

荧光原位杂交技术在细胞遗传学中的应用 fluenticsitibsitis（fish）iis是在20世纪80年代末通过现有的辐射原位杂交技术发展起来的一种非辐射分子遗传技术。它提供了将特定DNA片段和特定的真核生物细胞的染色体区带联系起来的快速而有效的手段,是研究DNA序列在染色体上位置的最直接方法,自问世以来就广泛应用于生物学研究中,笔者就该技术的研究进展作进一步介绍。 1 非放射性原位杂交技术的建立 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA 探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA 获得成功之后,Pardue 等同年又以小鼠卫星DNA为模板,利用体外合成的含3H的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交,从而开创了RNA-DNA 的同位素原位杂交技术。它们都是采用放射性同位素标记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。1975年,Manning 等最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记,通过细胞色素C将生物素与RNA 分子连接起来。1977年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交(Nonisotopicin situhybridization,NISH)。1981 年,Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP) 成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopicin situhybridization),至此,以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年这项技术被引进到植物。1986年,Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。 2 荧光原位杂交 荧光原位杂交技术原理是将DNA探针用生物素和毛地黄毒苷等荧光染料标记,然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结合,通过荧光杂交信号来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。 与其他原位杂交技术相比,荧光原位杂交具有很多优点,主要体现在:①FISH不需要放射性同位素作探针标记,安全性高;②FISH的实验周期短,探针稳定性高;③FISH能通过多次免疫化学反应,使其杂交信号明显增强,从而提高灵敏度,检测的灵敏度接近同位素探针杂交;④FISH的分辨率高达3~20 Mb;⑤FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的DNA探针,再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子,因此可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位,直接得到它们的相关位置和顺序,从而大大加速生物基因组和功能基因定位的研究。 3 原聚光刻技术的检测类型和标记方法的发展 3.1 检测类型 3.1.1 重复序列和荧光定量序列的杂交 在特异染色体类型上重复序列可达106拷贝数,rRNA 基因、端粒重复序列、着丝粒重复序列以及类似于a卫星、卫星Ⅲ类等这些重复序列现已被克隆,在进行FISH时,他们的杂交靶位通常大于1 Mb,与靶位紧密结合产生强烈和浓缩的杂交区域,易于检测,主要用于快速检测染色体单体和三倍体。 3.1.2 dna的平均构成 在高等植物基因组中有一些高频率的重复序列, 在进化上很少具有保守性,编码序列在染色体总DNA中的比例只有不足0.5%,中度和高度重复序列构成了植物基因组的绝大部分DNA序列。由于它们在探针和靶DNA中具有较高频率,因此如果以基因组DNA为探针, 这些存在于靶序列和探针之间的高度重复序列会首先退火, 超过那些单一和保守的序列, 因而杂交表现出种的特异性,故应依据各染色体组DNA 同源性程度的差异进行种属特异性标记。 3.1.3 大克隆载体 杂交位点检测率随探针大小的降低而降低。对于存在于基因组内的单拷贝基因, 检出的最好方法是使用含有插入片段的较大克隆载体, 如全Cosmids可载40 kb的插入片段,YACs载体能载约100 800 kb的片段。据报道,含有小到2 kb目标序列的质粒探针用FISH 已被定位,但其杂交效率不尽如人意(20%~50%)。主要进行染色体克隆DNA定位及检测靶细胞序列拷贝数和结构变化。 3.1.4 微切探针phing 由一条染色体或其上某一区域的不同核酸片段组成,可由克隆到噬菌体(phage)和粘质粒(cosmids)上的染色体特异性大片段插入文库制取,且微切文库探针片段小,与邻近区域发生重叠及制片过程中被破坏的可能性小。这类探针可用于中期染色体重组和间期核结构分析。 3.1.5 寡核苷酸r