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柑橘绿霉病菌拮抗酵母菌的筛选及防治效果 柑橘霉菌是柑橘贮藏过程中的主要疾病。目前,柑橘采后病害的防治主要依赖于化学杀菌剂,如抑霉唑、噻苯咪唑、二甲嘧菌胺、咯菌腈等,但长期使用化学杀菌剂易造成环境和食品污染,同时也易诱发病原菌产生抗药性。随着人们对果品质量要求的不断提高和环保意识的增强,很有必要开辟能够代替化学药剂的安全、无毒且有效的生物试剂,微生物生防剂即是其中的一种。 用于采后生物防治的拮抗微生物包括细菌、放线菌以及酵母菌,其中酵母菌以其拮抗效果好、不产生毒素、可以和化学杀菌剂混用等优点成为采后病害生物防治研究的热点。近年来,国内外学者就拮抗酵母菌用于果蔬采后病害防治进行了广泛研究。Zahavi等用假丝酵母(Cryptococcu oleophila)防治由灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)及黑曲霉(Aspergillus niger)引起的腐烂病,取得了良好的防治效果;Janisiewicz等用罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)处理苹果果实,可有效地预防青霉病的发生;梁学亮等研究了假丝酵母(CandidaSp.)CWW-4对柑橘采后绿霉病的防治效果;陈丽锋等筛选到1株拮抗酵母菌,经鉴定为欧诺比假丝酵母,并首次将该酵母菌应用于果蔬的保鲜。目前,拮抗酵母菌假丝酵母(Candida oleophila)、白色隐球酵母(C.albidus)在美国和南非已实现了商品化,并已广泛用于果蔬采后的病害防治。本研究通过离体及果实接种试验,对能有效防治柑橘绿霉病的拮抗酵母菌进行了筛选和鉴定,并对其抑菌效果进行了研究,以期为柑橘绿霉病的生物防治及综合防治技术的应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 主要材料 1.1.1 全粒砂糖柑的消毒 选择外观整齐、大小一致、无病虫害、无机械损伤且未经过采后处理的砂糖柑果实,运到实验室后立即用质量分数2%的次氯酸钠溶液消毒5 min,自来水冲洗,晾干后待用。 1.1.2 马铃薯葡萄糖运行液的配制 柑橘绿霉病菌(P.digitatum)分离于自然发病的柑橘果实,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养7～14 d,用含有质量分数0.05% Tween 80的无菌水配成孢子悬浮液后,用血球计数板配制成浓度为106mL-1的孢子悬液。 1.2 菌种的培养、筛选 参考Wilson等的方法,并作一定调整。从华南农业大学园艺果园采集木瓜、梨、柑橘果实样品,采集后立即用刀片切成2 cm×2 cm的小块,每份样品称取10 g,加入到装有90 mL豆芽汁葡萄糖液体培养基的三角瓶中,然后加入几滴质量分数0.1%的硫酸链霉素,置于恒温摇床上振荡培养(26 ℃、120 r/min)48 h。用移液枪移取1 mL菌液,用浓度梯度法稀释后,分别取稀释10-3,10-4,10-5倍的菌液100 μL,涂布于豆芽汁葡萄糖琼脂培养基平板上,置于25 ℃恒温培养箱中培养48 h,然后挑取培养特征相异的单菌落,经反复纯化培养后编号,保存备用。 菌株筛选采用酵母菌与柑橘绿霉病菌混菌试验,用无菌水制备108,107,106,105CFU/mL的酵母菌悬浮液,将柑橘绿霉病菌制成106,105,104mL-1的孢子悬浮液,分别各吸取1 mL移入20 mL 50 ℃左右的豆芽汁葡萄糖培养基中,混匀后倒入无菌平皿中置水平位置冷却。于28 ℃培养2～10 d,每处理3个重复,试验重复2次,分别于培养的第2,6,10天观察并记录菌落生长情况,筛选对柑橘绿霉病菌具有较强拮抗作用的拮抗酵母菌株。 1.3 有关tea胚胎血浆培养的确定 1.3.1 生理生化特征 参照文献的方法,鉴定菌株HP-10的生理生化特征。 1.3.2 植物基因组dna提取 采用酵母菌18S rDNA的通用引物EF3(5′- TCCTAAATGACCAAGTTTG-3′)和EF4(5′-GGAAGGGRTGTAT-TTATTAG-3′)进行PCR扩增。酵母菌总DNA的提取,参照上海生工生物工程技术服务有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒进行。反应体系(50 μL)为:模板DNA 1 μL,引物EF3(10 μL/L)和EF4(10 μL/L)各1.5 μL,2×PCR MasterMix 20 μL,双蒸水26 μL。PCR程序如下:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,48 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共循环35次;最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR产物纯化后测序,测序由上海英潍捷基生物技术有限公司完成。 在GenBank数据库,中利用Blast对所测定的18S rDNA序列与已报道的酵母菌菌株的18S rDNA全序列进行同源性比较,然后应用MEGA 3.1和DNAMAN软件进行同源性比对,并构建系统进化树。 1