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番荔枝根腐病的发生与防治 又名半荔枝、释迦牟尼果、林芙。是世界5大名果之一,属番荔枝科(Annonaceae)。番荔枝已报道病害有50多种。其中,根腐病是番荔枝的重要病害,是制约番荔枝产业发展的主要因素之一。受侵染植株根部的皮层及木质部变黑腐烂,有些病根表面长有菌索;地上部分叶片逐渐变黄,最后整株枯死(图1-3)。在广东湛江市郊的南亚热带作物研究所(南亚所,下同)的番荔枝园,每年均有30%左右因根腐病而枯死,2004年发病率高达36.8%。此病一般在种植后3年后开始出现,若有台风影响时感病更重。 对番荔枝根腐病病原菌的鉴定已早有报道,但各地的报道不一。戚佩坤等从番荔枝幼苗病根中分离到Cylindrocladiella tenuis Zhang C.F.et P.K.Chi.为根腐病的致病菌。而莫晓凤等从进境的番荔枝幼苗中分离到了番荔枝根腐病病原菌潮湿镰刀菌Fusarium udum Butler。高爱平等报道,番荔枝幼苗根腐病由Pseudomonas solanacearum引起,受其侵染后根颈腐烂,根木质部组织变黑,树体衰弱致死,在海南粘重板结的砖红壤中,由此病原菌引起的根腐病发病率可达30%。Hayward也报道了P.solanacearum引起番荔枝幼苗根腐病。Fitzel等从番荔枝成龄树中分离到了Pythium sp.和Phytophthora sp.,此2种病菌均可引起番荔枝根腐及树体衰退。 在根腐病的防治方面,有效的防治措施报道较少。随着无公害农业或绿色食品生产的发展,利用拮抗微生物进行生物防治是一种很好的策略。将培养好的拮抗微生物施入土壤中,并在土壤中繁殖,可降低土壤中病原菌的密度,并对病原菌有抑制作用,减轻病害的程度。如Fang等用强壮青霉(Penicillium funiculosum)防治柑橘疫霉根腐病。Sswant等用哈茨木霉(Trichoderma harziamum)、绿木霉(T.viricde)和绿色粘帚霉(Gliocladium virens)防治由寄生疫霉(P.parasitica)和芋疫霉(P.colocasiae)引起的柑橘根腐病,可以减少吸收根的腐烂,增加树体的生长量。 综上所述,番荔枝根腐病病原菌的鉴定已有不少报道,而发病率较高的南亚所果园的病原菌尚不清楚。因此,本研究对南亚所的番荔枝根腐病病原菌进行了初步鉴定,然后筛选对其病原菌有拮抗活性的生防真菌,为番荔枝根腐病的无公害防治打下基础。 1 材料和方法 1.1 保定市试剂、抗病性分离 番荔枝病根采集自广东湛江市郊的南亚所番荔枝种植园,均为成龄结果树的病根。 1.2 培养基的选择 V-8选择性培养基Ⅰ和Ⅱ的配制,分别用于对疫霉菌和腐霉菌的分离:V-8汁340 mL,加CaCO35 g稍加热溶解,离心(4 000 r/min,20 min),取上清液,加蒸馏水定容至3 000 mL,分装到15个250 mL的三角瓶,每个瓶装200 mL,每瓶加入琼脂4 g,高压灭菌。选择成分Ⅰ:Benomyl 80μLg/mL,Rifampicin100μg/mL,Nystatin 50μg/mL,Hymexazol 80μg/mL,Ampicillin 100μg/mL;选择成分Ⅱ:Benomyl 80μg/mL,Rifampicin 100μg/mL,Nystatin 50μg/mL,Ampicillin l00μg/mL。加入选择成分Ⅰ时为“V-8选择性培养基Ⅰ”,加入选择成分Ⅱ时为“V-8选择性培养基Ⅱ”。 PA培养基:马铃薯琼脂培养基,不加入葡萄糖,用于其他真菌的分离。 PDA培养基:常规的PDA培养基,用于保存菌种。 1.3 人才培养方向 切取表现典型根腐病的病根病健交界处的组织,切成5 mm×5 mm小块。然后把这些小块分成3部分,第1部分直接置于V-8选择性培养基Ⅰ上培养;第2部分直接置于V-8选择性培养基Ⅱ上培养;第3部分则先用75%酒精消毒1 min,再用0.1%的HgCl2消毒1 min,后用灭菌水洗5次,置于PA培养基上培养。对每个分离物分别进行纯化培养,并保存于试管斜面上备用。 1.4 用分生孢子悬浮液接种 取普通番荔枝(A.squamosa)种子播种,盆栽小苗,土壤事先灭菌,每盆取10株高度粗度一致的小苗做致病性测定。取疫霉菌菌丝块置于灭菌水中,28℃下培养1-2 d,待长出孢子囊后放入4℃冰箱中5 min,让其释放游动孢子,制作游动孢子悬浮液,淋于小苗根部。腐霉菌以菌丝接种,其它真菌均用分生孢子悬浮液(约106个/mL)接种。接种后保湿48 h,观察发病情况,后期进行再分离。每处理一盆10株,重复3次,对照用无菌水。18 d后调查发病率。 1.5 形态鉴定方法 对有致病力的菌株分别进行鉴定。疫霉菌鉴定:从V-8培养基平板上观