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植物种质资源超低温保存研究进展 植物种类可分为四种类型：正常性种子、中间性种子、顽固的种子和无性繁殖。能产生正常性种子的植物种质资源通常是在低温库以种子形式进行保存。不能产生正常性种子的植物种质资源通常在田间种质圃、植物园、原生境保护区(点)进行野外保存和在试管苗库、超低温库进行离体保存。 随着环境的恶化,极端天气频发,强度不断增大,野外保存资源的安全性受到的威胁日增。试管苗保存种质需要按期继代,有可能发生污染导致材料丧失。另外,随着培养时间的延长,试管苗在贮藏时有可能发生一些变异,且变异的可能性将随着保存时间的增加而增大。超低温保存以其安全、稳定、长期、经济的显著优点,正逐步发展成为与野外保存并行且互补的长期安全有效保存方式。 植物种质资源超低温保存一般是在液氮(-196℃)及液氮蒸汽相(-150~-180℃)的超低温条件下保存植物细胞、组织或器官。植物材料在如此低的温度下,调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制,新陈代谢活动基本停止,处于“生机停顿”或“假死”状态。经过超低温保存后,处于“假死”状态的植物材料能保持正常细胞的活性、形态发生潜能和遗传稳定性,从而达到长期保存植物材料的目的,理论上可以无限期保存种质资源。超低温保存将尽可能避免组织、细胞继代培养及自然界中积累性突变等的发生,是非正常性种子植物和无性繁殖植物种质资源长期安全保存方法,也是生物技术材料有效、安全、稳定、经济、长期保存的唯一方法。 1 在低温下的基础上的科学研究 1.1 超低温保存的材料 由于植物的繁殖特性、种属、基因型、抗冻性不同,适宜进行超低温保存的种质外植体材料类型也有所不同。目前成功进行超低温保存的材料类型有种子、休眠芽、茎尖分生组织、花粉、合子胚(胚轴)、体细胞胚、悬浮细胞、愈伤组织、原生质体等。各类型材料的优缺点及适用物种见表1。 1.2 低温储存的基本程序 超低温保存基本程序为:材料选择与准备→预处理→降温冷冻→化冻→存活鉴定→遗传稳定性分析。 1.2.1 不同材料类型对超低温保存效果的影响 由于材料的特性(植物的基因型、抗冻性及细胞、组织和器官的年龄、生理状态等)、材料大小、取材部位均影响超低温保存效果[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13],因此,应根据植物种类,选择适宜进行超低温保存的不同材料类型,并适时取材,一般选择指数增长期的细胞。 1.2.2 种子预处理 预处理目的主要是提高分裂相细胞的比例和减少细胞内自由水含量,使材料达到最适于超低温保存的生理状态。预处理的方法有低温锻炼和预培养。茎尖分生组织、胚(轴)和顽拗性种子预处理的一般方法是在0~4℃进行人工低温锻炼1~6周或用不同浓度蔗糖或甘露糖的培养基进行1~7 d的预培养。在预培养时有的需要逐步提高蔗糖浓度,有的需要添加ABA等激素,有的则需缩短光照时间。休眠芽或枝条预处理的方法是在0℃进行低温锻炼不同时间。有的则需逐步在0℃以下温度处理不同时间,如-3℃,14 d→-5℃,3 d→-10℃,1 d。花粉一般不需要进行预处理,有的则在投液氮前需在-20℃进行预处理。 1.2.3 冷却和冷冻 降温冰冻方式主要有4种:1)快速降温;2)慢速降温;3)两步降温;4)逐级降温。 1.2.4 材料的选择方法 不同类型的保存材料以及用不同的冷冻前处理和降温冰冻方式处理所得材料,其化冻方法也相应不同,主要有常温化冻、快速化冻和慢速化冻3种方法。化冻方法的选择关键是防止化冻过程中细胞内次生结冰和化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。细胞再次结冰的危险温度区域大约是-50~-10℃。用玻璃化液处理后的材料和采用快速降温法处理后的材料一般在37~45℃温水浴中进行快速化冻1~3min,具体时间长短依材料而定,如滴冻法处理的材料化冻时只需几秒。花粉通常在室温下进行常温化冻或置于37~38℃温水浴中进行快速化冻。休眠芽需在0℃缓慢化冻或37~38℃温水浴化冻。 1.2.5 常用材料类型 超低温保存后存活鉴定及评价指标与所用的超低温保存技术、材料类型及其再生方式有关,主要有存活率(细胞活力快速染色法、再培养法等)、再生率、萌发率、嫁接成活率、坐果率和结实率等,各种方法的原理、适用材料类型及优缺点详见表2。 1.2.6 超低温保存材料对材料dna甲基化的影响 保存后材料不发生遗传变异是种质资源保存的一个关键点。超低温保存中材料经受了一系列逆境胁迫,易诱导超低温保存材料及其再生植株产生变异。因此,必须在利用超低温进行常规大量长期保存植物种质资源前证实超低温保存后材料遗传稳定。目前采用多种方法从各个水平对超低温保存后的遗传稳定性进行了评价。细胞、花粉、茎尖、种子等材料超低温保存后在表现型、生化方面(可溶性蛋白和同工酶)、染色体结构和倍性、分子水平(ISSR、RAPD和AFLP