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植物组织培养中常见的污染问题 植物组织培养是20世纪初以植物为基础的一项新兴技术。该技术在科学研究和生产中得到广泛应用，是世界著名生物技术的重要组成部分。特别是近几年,不少组织培养工厂应用该技术大量生产花卉、蔬菜及特种经济植物幼苗、脱毒苗,使作物种植逐步摆脱周期长、完全受自然控制的分散状态,逐步走向集中控制、规模化、自动化、不受自然影响的工厂化生产。尽管组织培养方面理论研究已相当精深,但技术方面仍存在很多问题。因此,如何获得无菌苗也成为亟待研究的问题。在总结分析有关文献的基础上,结合多年生黑麦草Lolium perenne组织培养研究中的实践,介绍和讨论了组织培养中的污染原因及其对策。 在组织培养中污染经常发生又难以控制。造成污染的原因多种多样,如外植体的种类,取材的季节、时间、预处理方法,消毒药剂的种类、浓度,消毒时间,消毒方法,培养基和器皿灭菌,操作人员,工作环境,超净工作台的工作质量等都与污染密切相关,导致污染成因的复杂性。依据上述因素,将污染原因归结为3个方面:一是组织培养室或接种室的清洁问题;二是外植体自身带菌;三是组织培养过程各环节操作不适宜或不严格。 1 接种室的消毒 在进行组织培养之前,首先要建立实验室。实验室包括准备室、无菌操作室(接种室)和培养室。植物组织培养是一种要求做到无菌操作和无菌培养的技术(这种技术有2个主要目的:一是防止实验室的培养物被外来微生物,如皮肤、衣服或周围环境中的微生物污染;二是防止实验工作者被微生物感染)。组织培养室或无菌操作室的污染源主要是空气中的细菌和真菌孢子,若培养室内不清洁就会引起细菌和霉菌污染。因此在接种室每次接种前必须进行彻底地消毒,常用的方法是先用70%酒精在室内喷雾使空气中的细菌和真菌孢子沉降,在接种前后要用70%的酒精或者1∶50的新洁尔灭湿性消毒溶液擦洗超净工作台,每次接种前还要用紫外线灯照射20~60 min,以净化空气,工作人员不能在停止照射后即刻进入室内,以免紫外线辐射对人体的影响。接种前应再次进行超净台台面消毒,可用新洁尔灭湿性消毒溶液擦抹和70%酒精消毒,保证超净工作台处于严格的无菌状态。在接种后要及时打扫卫生(清洁工具如扫帚、拖把必须消毒),用2%的新洁尔灭溶液擦洗地面、墙壁和门窗。组织培养室要经常用70%酒精喷雾和2%的新洁尔灭溶液擦洗地面和门窗。有些真菌适应性很强,上述措施不一定奏效,因此,对组织培养室或接种室一般用高锰酸钾和甲醛每周熏蒸1次,甲醛用量4~6 mL/m3,高锰酸钾3~6 g/m3。 2 组织性微生物污染 在组织培养中,无菌的外植体是植物组织培养取得成功的最基本前提,特别是在热带、南亚热带,由于常年高温多雨,空气湿度大,在植物茎叶表面容易滋生大量的微生物,一些菌丝体甚至侵入表皮内的薄壁组织,不能被一般的表面消毒方法所清除,材料被带入组织培养过程中易引起内生菌的污染,如细菌的污染。因此,必须选择合适的外植体(如成熟的种子、健壮植株等),并进行严格的消毒和无菌操作,以确保组织培养工作的顺利进行。 2.1 采用外植体法生产大型植物 外植体的选择要以污染少易启动(易培养)为原则。迄今为止,组织培养获得的成功,几乎包括了植物体的各个部位,如茎尖、茎段的皮层及维管组织、髓细胞、表皮,块茎的贮藏薄壁细胞、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。其中植物胚不易被污染且具有幼嫩的分生组织细胞,是常用的外植体。另外在用茎尖作外植体时,可在室内或无菌条件下对枝条进行预培养,如将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中,使其抽枝,然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体,污染率可下降到20%~30%。罗小芳等人在金丝小枣Ziziphus jujubavar.inermis快繁中用休眠芽、室外嫩茎及水培嫩芽为外植体,得出水培嫩芽的污染率为31%,存活率高达63.3%,而休眠芽和室外嫩茎的污染率分别为46.2%,77.1%,成活率16.25%,17.14%。在无菌条件下对枝条进行暗培养,待抽出徒长的黄化枝条时再采取枝条,也可明显减少污染。另外也可用成熟种子在无菌条件下经严格消毒培育成无菌苗,然后采用无菌芽苗的胚轴、胚根、子叶等为材料,也可减少污染,笔者在多年生黑麦草的组织培养中采用此法。同时,应避免阴雨天在户外采取外植体。在晴天采料时,下午采取的外植体要比早晨采的污染少,这主要是因为经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。当然,外植体的选择在考虑污染控制的同时,还应考虑外植体的分化率问题。例如,在控制污染条件一致的情况下,百合科Liliaceae植物鳞茎不同部位的再生能力差别很大,外层鳞片叶比内层的再生能力强,下段比中、上段再生能力强;多年生黑麦草的草坪草品种百瑰易灭菌,但分化率极低。因此,组织培养过程中,选择不易污染且易表达全能性的外植体,是成功建立组织培养体系的决定因素