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植物组织培养的研究进展 哈布兰特提出了细胞全能性理论以来，经过无数科学家的努力，通过80多年的分离栽培过程，其培养技术逐渐改进和成熟。近40年来, 植物组织培养技术得到了迅速发展, 已渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种学以及生物化学等各个研究领域, 成为生物学科中的重要研究技术和手段之一。并广泛应用于农业、林业、工业、医药业等多种行业, 产生了巨大的经济效益和社会效益, 已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。 1 植物组织培养 在无菌条件下, 将离体的植物器官 (如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等) 、组织 (如形成层、花药组织、胚乳、皮层等) 、细胞 (如体细胞、生殖细胞等) 、胚胎 (如成熟和未成熟的胚) 、原生质体 (如脱壁后仍具有生活力的原生质体) 培养在人工配制的培养基上, 给予适宜的培养条件, 诱发产生愈伤组织或潜伏芽等, 或长成完整的植株的技术, 统称为植物组织培养。由于是在试管内培养, 而且培养的是脱离植物母体的培养物, 因此也称离体培养和试管培养。 2 植物细胞生物学理论 植物组织培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年, 德国著名植物学家G.Haberlandt根据细胞学理论, 大胆提出了“高等植物的器官和组织可以不断分割, 直至单个细胞 (即植物体细胞) , 且在适当的条件下, 具有不断分裂和繁殖, 并发育成完整植株的潜力”的观点。1943年, 美国White在烟草愈伤组织中偶尔发现形成一个芽, 证实了G.Haberlandt的论点。 3 用或完善的培养基培育新植株 组织培养的基础培养基有MT、MS、SH、White、N等。由于不同植物所需要的生长条件有所不同, 有的需要对培养基做一些改良, 有的要选用专用培养基。在组织培养中, 愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。在基础培养基里添加一定浓度的外源激素, 可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官, 最终可获得再生植株或次生物质。常用的激素类型有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类等。 4 iaa的调节作用 IAA能促进细胞壁的扩张和诱导纤维素酶的形成。Hail从燕麦芽鞘分离出原生质体, 它可以保存在11%的蔗糖溶液中, 若添加少量IAA (0.1 mm) , 只需5 min原生质体就会破裂。这是IAA首先作用于质膜的一个证据。当IAA直接同原生质膜结合时, 引起膜构象和透性的变化, 增加了离子流动, 产生生物电位变化或一系列代谢变化, 发生快速效应。如IAA活化原生质膜上的ATP酶, 引起H+从细胞质流向细胞壁, 活化细胞壁水解酶, 或直接打断壁中酸不稳定共价键或氢键, 使壁弹性增加, 利于生长。用IAA处理菜豆下胚轴, 使纤维素酶活力增加100倍, mRNA增加10倍, 从中分离到纤维素酶的mRNA。用免疫电泳证明IAA能在麦胚无性细胞系中翻译成纤维素酶蛋白。说明IAA调节作用发生在转录水平和翻译水平上。 关于2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸) 诱导体细胞胚胎发生的作用机制已有不少研究, 它可以诱导一些特异蛋白质形成, 2, 4-D的浓度与DNA甲基化有关, 通过改变细胞内源IAA代谢而起作用等。 KT (激动素) 能并入核酸中, 影响RNA的种类和数量, 能促进蛋白质合成, 同时能延缓药壁的衰退, 具有促进愈伤组织形成茎叶的作用。 CTK对硝酸还原酶的合成有明显的调节作用。Kende以麦仙翁种子为材料, 证明BA可以诱导硝酸还原酶蛋白的重新合成。陈微用蛋白合成抑制剂——环己亚胺, 阻抑了6-BA (6-苄基腺嘌呤) 的这种诱导作用。叶叙丰用紫外线诱变技术, 在氯酸盐培养基上选得了缺少硝酸还原酶活力的突变细胞株。陆嘉陵等发现这些细胞中含6-BA受体位点比对照明显少, 它们即使生长在加有6-BA的培养基上也不能变绿。据此,张德颐 (1983)等认为, 突变体由于合成6-BA受体蛋白的基因位点发生了变化, 减少了受体蛋白的合成, 6-BA不能正常地大量接合到受体蛋白上, 无法转移至DNA, 不能启动硝酸还原酶有关基因的转录, 无硝酸还原酶前体的形成, 从而细胞无法变绿。 GA诱导α-淀粉酶的合成。杨文钰等 (1997)用GA3处理发芽的大麦、小麦和黑麦种子能诱导出α-淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、磷酸酯酶和过氧化物酶。胚乳切片和糊粉层的离体培养证明GA3诱导α-淀粉酶的的形成, 洗去GA3, α-淀粉酶的合成停止。诱导过程中加入蛋白合成抑制剂 (3’-脱氧腺苷) , α-淀粉酶合成大大受抑。同时发现:经GA3处理后, 大麦糊粉层中RNA增加。当用14C-尿核苷处理时, 糊粉层中有放射性的RNA, 表明GA3加速了转录。现已发现GA3可影响大麦糊粉层和玉米盾片的核酸甲基化, 同时也调节5’-末端的7-甲基