植物组织培养中污染的分析与防治.docxVIP

植物组织培养中污染的分析与防治 自20世纪初以来，植物组织的形成和发展经历了一个整合阶段、基础阶段和快速发展阶段。近年来, 随着植物组织培养基础理论的深入研究, 其发展迅速, 应用范围也更广泛, 在农业、林业和医药等领域产生了巨大的经济效益和社会效益。虽然植物组织培养基础理论研究水平很深, 但是污染问题时有发生, 严重时会导致试验和生产彻底失败, 使科研和生产蒙受巨大损失。控制污染的发生, 尤其在珍贵种质资源保存和大规模工厂化生产用苗中显得尤为重要。本文就植物组织培养中污染产生的原因以及控制措施作以论述。 1 污染原因 1.1 不同部位材料带菌培养 (1) 年龄、种类和大小。成年植株带菌多;生理年龄老的材料带菌多;杂菌和内生菌多的外植体、有病虫害的植株, 均易污染;室外生长的材料带菌多;表面有泥土的材料、地下器官均带菌多;表面积大的材料比表面积小的材料带菌多。 (2) 取材时期和部位。雨季菌类繁殖旺盛, 此时材料带菌多;阳光最强时紫外线较强, 杀菌效果好, 此时材料带菌较少;选取了不清洁、生长不旺盛部位的材料带菌多。 (3) 灭菌效果。外植体灭菌是组织培养的关键, 灭菌效果直接决定了组织培养的成败, 灭菌方法和灭菌剂处理不当导致灭菌效果差, 使外植体带菌。 1.2 培养容器、接种室和培养室污染 (1) 培养基。使用长菌的母液配制培养基;培养基p H值高、添加的有机成分均可导致细菌污染;培养基分装好后没有及时封口或封口后没有立即灭菌;培养容器口没有封严导致灭菌后细菌和真菌孢子再次进入培养容器使培养基污染;封口用的塑料盖、封口膜长时间在日光灯照射下易老化、破裂, 导致密封性差, 不慎使用后可能导致培养基污染;橡皮筋长时间在日光灯照射下也易松动、断裂, 杂菌可能趁机进入培养容器;灭菌方法不当导致培养基污染;灭菌时间过短导致培养基灭菌不彻底;灭菌时间达到后立即打开灭菌锅, 导致容器内压力差过大, 使外部杂菌有可能被倒吸入容器中;过滤较多溶液后, 滤膜过滤效果较差, 使过滤后的溶液有菌, 加入培养基后造成污染。 (2) 培养容器和接种器具。培养容器不清洁;培养容器被污染后灭菌不彻底, 再次使用时导致污染;高压灭菌锅或烘箱内培养容器、接种器具装得过满, 影响灭菌效果;培养容器、接种器具灭菌时间过短导致灭菌不彻底;灭菌结束后立即打开高压灭菌锅或烘箱, 强烈的冷热对流会导致冷空气被吸入包扎层内而重新造成污染带菌。 (3) 接种人员。过长指甲;双手未清洗干净;衣服和头发有很多灰尘, 接种时不换拖鞋、接种服、帽子和口罩;不慎将已污染的培养材料拿入超净工作台, 转接后再次污染;培养容器中接种的培养物过多;超净工作台上物品摆放过多、过高使气流被挡住, 导致灭菌效果差;接种时说话或咳嗽会呼出大量细菌;操作时手超出工作台面;手接触培养容器边缘, 放在器皿、接种器械上方致使微生物落入培养容器中;打开培养容器的塞子、盖或封口膜时空气进入带来灰尘;接种过程中器械被手或带菌材料污染后未经消毒, 再次使用后又污染了材料;没有在超净工作台下风方向操作而使菌类随风飘落到容器中;中途离开超净工作台后马上又继续接种, 将培养基、器械等物品拿入超净工作台继续接种而带入灰尘, 顺风飘入器皿。服装、帽子、口罩、拖鞋长期穿戴后较脏, 表面有大量灰尘, 未经清洗反复穿戴后造成污染。 (4) 接种室和培养室。人员的进出导致接种室和培养室空气中存在大量细菌和真菌, 尤其是接种过程中非工作人员的进出;接种室设计不合理, 造成室内灰尘、细菌过多;超净工作台置于灰尘太多的地方, 过滤装置使用过久、保养不当造成失效;组培室、接种室门窗封闭不严, 苍蝇等趁机飞入, 利于杂菌传播;培养室面积大易污染, 室内温度高、空气湿度大, 菌类繁殖旺盛也会加重污染。 2 避免措施 2.1 外植体的选择和消毒 2.1.1 黄化病植株的选择 选取幼年植株或生理年龄为幼态的材料;外植体要求杂菌少、易启动且内生菌少, 宜选取生长健壮的植株材料, 如胚和无病害的茎尖;从温室或人工气候室生长的植株上选取外植体, 选取水培抽出的茎段、叶片等;新萌发的萌蘖条, 新生的枝条、茎尖、叶片、叶柄;黄化处理后的枝条;表面污染较重的可对母本植株进行修剪, 待长出新枝后再取外植体;选取表面积小的材料。一般以材料积累了丰富的营养和内源激素为宜, 此时材料抵抗病原菌的能力较强或病菌较少, 以材料休眠末期或萌动前期取材较为有利, 取材多在晴天中午阳光最强时进行;取材部位以材料中下部较好。 2.1.2 次氯酸钠的杀菌效果 灭菌剂需有良好的灭菌效果, 不会对外植体造成损伤或损伤较小, 且容易用无菌水冲净或能自行分解, 不会在外植体上残留而影响其生长。常用的灭菌剂有70%酒精、0.1%~1%升汞 (氯化汞) 、1%~10%滤液的漂白粉、0.5%~