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植物组织培养中的褐化现象 黄褐色是植物组织培养中常见的现象，也称为棕褐色，通常发生在植物组织培养、细胞悬挂培养和原生质体培养中。 1 黄褐色的原因 1.1 自然死亡说 非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡,即坏死形成的褐变现象,并不涉及酚类物质的产生。诸多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡,但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。 1.2 外植体或培养材料生理条件对酚氧化酶活性的影响 多数认为,植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐变引起的,即由多酚氧化酶(PPO,Polyphenol Oxidase)作用于天然底物酚类物质而引起的。在正常条件下,细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡,醌类物质水平较低;而酚氧化酶及其底物分布在正常组织的不同部位,酚类物质分布在细胞的液泡内,酶则分布在各种质体或细胞质内,这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来;但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境,或细胞受伤或衰老时,细胞膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏会导致酚氧化酶释放或合成,如果此时在合适的pH和温度等条件下,酚氧化酶、酚类(底物)和氧发生酶促氧化反应,形成有毒的棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。此外,组织的老化或病变也可激活酚氧化酶而引起褐变。 一般认为,褐化是指外植体或培养材料接种后在组织培养过程中,由于切割造成机械损伤,伤口处分泌出酚类化合物,在有氧的条件下,切面细胞中的酚类物质为多酚氧化酶催化,氧化为醌,醌再通过非酶促反应产生有色物质而导致组织褐变,变成棕褐色或暗褐色,并逐渐扩散到培养基中,抑制细胞内其它酶的活性,影响细胞的正常代谢,毒害整个组织,甚至导致组织死亡。尤其是木本植物组织的外植体褐变死亡是其培养难度较大的主要因素。因此,探讨褐化发生的机制及其影响因素,采取有效的防止褐化的措施,是保证植物组织培养成功的关键所在。 2 影响棕榈树的因素 植物组织培养过程中的褐化现象,引起植物材料褐变的因子是复杂的,往往是多种因素共同作用的结果。 2.1 组织培养中褐变的情况 褐化与植物本身的内在因素有关,不同种类植物、同种植物的不同类型和品种在组织培养中褐变程度有很大差别。一般来说,多年生木本植物比草本植物容易发生褐变,因为木本植物的单宁或色素含量较高,而酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体,所以易褐变。 2.2 接种后褐变程度的变化 在植物组织培养中,培养材料或外植体的褐变是导致培养失败的主要原因,材料本身的生理状态不同,接种后褐变程度也不同。刘兰英在薄壳香核桃组培的实验中发现,木质化程度高的外植体会促进褐化的发生。大量实验表明,材料在培养过程中的褐化程度与多酚氧化酶(PPO,Polyphenol Oxidase)活性及酚含量有关。 2.3 外植体的褐变发生的原因及引发因素 有关植物组织培养中褐变现象的研究已经很多,大量实验表明组织培养中褐变的发生及褐化的严重程度和外植体取材的时期、取材的部位、类型及外植体取材的大小及取材前的预处理有关。 2.3.1 植物研究 刘淑兰等对新疆核桃的试验证明,不同季节、不同树龄的外植体,褐化发生的情况不同,通常幼龄外植体比老龄外植体褐化轻,褐化率低。 2.3.2 外植体大小对褐变的影响 大量实验结果表明,外植体类型和取材部位是影响褐化重要因素。外植体的大小对褐变的发生及褐化和程度也有一定影响。小的材料更容易发生褐化,相对较大的材料褐化的程度较轻。 2.3.3 对外植体的影响 取材前外植体预处理对褐变的发生及程度有一定影响。周玉珍等实验发现取材母株放入温室和在相对弱光照下生长,其外植体的褐化率比在露地全光照下栽培母株低。低温预处理外植体可减少组织氧化褐变。 有研究认为,外植体接种于培养基中的放置方式对组织培养过程中的褐变现象也有影响;此外,外植体切口越大,酚类物质的被氧化面也越大,褐化程度就会更严重。 2.4 培养基产品 培养基的成分会影响外植体培养的褐变与褐化程度。 2.4.1 金属盐份的用量 基本培养基中无机盐的种类和浓度的选择对外植体生长的影响很大,培养基中的无机物可能是一些氧化酶合成及进行生理生化作用所必需的。浓度过高的无机盐可以引起外植体酚类外溢进而发生氧化,促进褐化的发生。因此,盐份越大,褐化程度越高。大量实验结果表明,同种外植体在不同培养基上产生褐变的程度不同。 2.4.2 生产生物碳源对褐化的影响 培养基中植物生长物质的种类、浓度及其组合对褐变起着重要的作用。培养基中附加激素种类的不同搭配,产生褐化程度也不同。有报道,细胞分裂素类物质会促使褐化的发生。生长素2,4-D或IAA可延缓酚的合成,减轻褐变产生。培养基中较高浓度的激素也会促进褐化发生。 此外,邱璐等研究表明,培养中使用含杂质较多的市售白糖褐化较重,