壳寡糖喷施对烟草花叶病毒的体外保护作用.docxVIP

壳寡糖喷施对烟草花叶病毒的体外保护作用 1979年，allan等人发现了壳聚糖的光谱抗菌性。有关壳寡糖的抑菌作用在医药、食品、农业等行业受到科技工作者的重视,并开展了一些研究。壳聚糖除了对食品腐败菌及动物病原菌具有一定的抑制作用外,对农作物病菌也有一定的抑制作用。关于壳寡糖对植物病毒病害的抑制作用研究较少。而烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的防治,至今仍缺乏有效治疗药剂,因此,选择合适的诱抗剂不失为有效的防治方法。本试验以壳寡糖处理植物病原菌及接种TMV的心叶烟(Nicotiana glutinosa)和普通烟(N.tabacum)烟草,探讨其诱导抗性作用机理,为该种新型农药在防治植物病毒病害上的应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 试验植物 心叶烟和普通烟NC89均保存于沈阳农业大学病毒研究室。 1.2 壳寡糖的制备 取30ml 1.0%的胶体壳聚糖,加入30ml pH5.0乙酸缓冲液稀释的巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)BS-506发酵酶液,55℃反应不同时间,沸水浴10min终止反应,加入10.0ml 0.25mol/L的NaOH,使未完全反应的壳聚糖沉淀,离心,去除沉淀,上清液经冷冻干燥制成粉末,配成不同浓度的壳寡糖溶液。对照壳寡糖溶液好普为2%的氨基寡糖素水剂,由大连凯飞化学股份有限公司生产。 1.3 地壳聚糖溶液的测定摩尔度 分别采用还原糖法和酸碱滴定法测定自制壳寡糖溶液的分子量和脱乙酰度。 1.4 壳糖对mtv的抑制作用 1.4.1 壳寡糖接种tmv 挑选长势一致的心叶烟,设4个处理: 分别在接种TMV前4、6、8、10d用浓度为40μg/ml壳寡糖进行处理,在壳寡糖处理的4d后统一常规摩擦接种法接种TMV。以清水喷洒为空白对照,以接种病毒前10d喷施稀释400倍好普为药剂对照。每处理5株,3次重复。接种后7d观察发病情况,计算病斑抑制率。 1.4.2 地壳糖限制了光线的正常传播，对tc9tv有抑制作用 采用普通烟NC89,处理方法同1.4.1,于接种后7d左右观察发病情况,调查病情指数,计算防效。 1.5 酶活性的测定 在接种TMV前4d用浓度为40μg/ml的自制壳寡糖溶液处理普通烟NC89,于接种TMV后的0、2、4、6、8、10、12d取样品1g,-20℃冰箱保存待用。将样品放入预冷的研钵中,加入0.2mol/L pH8.8的硼酸缓冲液1.5ml,冰浴中充分研磨后,转移至预冷的离心管,用1.5ml上述缓冲液冲洗,合并倒入预冷的5ml离心管中,10000r/min、4℃离心20min,上清液即为酶粗提取液。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定参照薛应龙方法,略有改动。多酚氧化酶(PPO)活性测定参照李靖等方法进行测定。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参照郝建军等的方法,略加改动。过氧化物酶(POD)活性测定参照张志良方法,略加改动。可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法。每处理3次重复。 2 结果与分析 2.1 地壳半糖测定的结果 壳寡糖的分子量为1850; 寡糖脱乙酰度为98.3%。 2.2 壳寡糖对tmv的防治效果 结果表明(表),壳寡糖对心叶烟上TMV具有较好的预防效果,病斑抑制率以接种TMV前10d处理的壳寡糖为最高,达到78.00%,与好普相比较,防治效果(79.10%)相当; 而提前4d处理的枯斑抑制率却很低,平均只有24.5%,有的几乎没有抑制效果。说明壳寡糖在心叶烟上对TMV的防效需要一定的诱导时间。壳寡糖对普通烟NC89具有一定的防治效果,但远不如在心叶烟上的效果好,防治效果在接种后10d处理达到最高,为32.41%,并且一般在接种病毒前8~10d喷洒效果较好一些,接种前4d喷洒基本没有预防效果。 2.3 壳体中的糖苷对草体内的预防 2.3.1 壳寡糖对烟苗pal活性的影响 结果表明(图1),健康对照PAL活性变化不大,烟草植株在壳寡糖诱导处理不同时间后PAL活性普遍较健康对照和接种对照酶活水平高,不同天数处理表现出不同的变化趋势: 在处理4~8d期间,壳寡糖处理后再接种的烟苗PAL活性呈大幅上升趋势,其中处理8d的PAL活性出现一个酶活高峰(518.21U/mg),与接种对照相比提高了35.94%。而在8~14d期间总体表现为下降趋势,与接种对照趋势相 似,但是仍高于接种对照酶活。由此可见,壳寡糖处理后再接种TMV的烟苗PAL活性都高,即防御抵抗能力较高,说明壳寡糖对诱导烟苗体内PAL活性提高起到了关键性作用。 2.3.2 pod活性的变化 结果表明(图2),健康对照POD活性变化不大,烟草植株在壳寡糖诱导处理不同时间后POD活性普遍较健康对照和接种对照酶活水平高。在接种TMV处理4~12d期间,用壳寡糖处理后再接种的烟苗