钩藤对癫痫模型海马脑片诱发场电位的影响.docxVIP

钩藤对癫痫模型海马脑片诱发场电位的影响 钩藤具有平肝健风、清肝泻的功效。其主要成分是蚓跺类生物碱。钩膝与牛膝配伍, 可有明显的抗戊四唑惊厥的作用, 单味钩藤对小鼠自主活动有明显抑制作用。天麻钩藤饮对小鼠有催眠作用。中医临床上用来主治肝风内动、惊痫抽搐。现代医学认为癫痫发作的电生理本质是神经元过度同步放电的结果。本研究以离体海马脑片CA1区锥体细胞诱发群锋电位PS的幅度为指标, 观察钩藤对毛果芸香碱致痫大鼠海马脑片诱发场电位的影响, 探讨钩藤对中枢神经系统的作用, 为中药治疗癫痫提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 药物、针剂、相对生物 实验对象为Wistar大鼠, 体重120～150 g, 雌雄不限。由天津市劳动卫生研究所实验动物研究中心提供。 盐酸毛果芸香碱 (Pilocarpine.HCL, 德国GMBH公司生产。由天津市化学试剂公司提供) 。纯品加蒸馏水配制成100 mg/ml浓度溶液。 钩藤提取液由天津市南开医院中西医结合研究所制剂室采用醇浸方法提取并制成1∶1 (1 g/ml) 注射针剂 (1 g生药制成1 ml提取液) 。 人工脑脊液 (artificial cerebrospinal fluid, ACSF) 成分 (mmol.L-1) :NaCl 124, NaHCO326, KH2PO41.2, MgCl2.6H2O 2.4, KCl 3.3, CaCl22.5, C6H12O6.H2O 10。 pH值为7.35。 1.2 制备癫痫模型 Wistar大鼠, 腹腔注射盐酸毛果芸香碱 (350mg/kg b.w) 制备癫痫模型。选取出现癫痫大发作的大鼠20只, 饲养一周后进行实验。 1.3 脑片的制备和人工诱导 致痫后7 d, 将大鼠随机分为对照组和实验组, 每组10只。将大鼠在清醒状态下断头, 迅速取全脑置于 4℃的人工脑脊液中持续给予95%O2和15%CO2饱和, 待脑组织冷却后迅速剥离出海马, 沿海马槽纤维平行方向将海马人工切成 350～400 μm厚的脑片, 并将脑片移至预先通以95% O2和5%CO2混合气的室温的ACSF中 (pH为7.35) , 室温下孵育1～2 h。 1.4 刺激电极诱发脑片电位 将孵育后脑片移至以上述人工脑脊液灌流的内浴槽, 灌流速率为1.25 ml/min。保持温度35℃。用微操纵器将充满生理盐水的玻璃微电极 (即记录电极) 插入海马CA1区锥体细胞层, 以引导诱发的场电位。刺激电极则置于CA3区发出的Schaffer侧支处。刺激参数为0.1 ms和1 Hz。由刺激电极诱发的场电位经记录电极引导, 经微电极放大器放大, 输入SBR-1型双线示波器, 经好友生物信号分析系统 (由天津医科大学研制) 转换至电子计算机进行观察、记录、测量、分析。实验时选取能记录出诱发场电位的脑片进行实验, 首先记录给药前的诱发场电位, 待其稳定30 min后再进行药物实验。给药后连续观察20～30 min, 记录诱发场电位幅度变化和恢复时间。给药途径选用脑片旁微量滴注法, 滴注量为20 μl (分四滴, 每滴5 μl) 。 本实验以滴加生理盐水为对照组, 观察钩藤提取液对致痫大鼠CA1区PS的影响。 1.5 处理数据 实验结果用均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示, 配对t检验, 利用SPSS统计软件进行统计学处理。 2 结果 2.1 滴注盐水前后 在10例致痫海马脑片的诱发场电位的记录中, 滴注生理盐水前后, 其幅度无明显变化 (P0.05) 。这说明, 脑片表面微量滴注生理盐水后, 对诱发场电位无明显影响 (图1) 。 2.2 钩藤对致痫海马脑片诱发场电位的影响 本实验观察了14例致痫海马脑片在滴加钩藤提取液前、后其诱发场电位的变化。实验结果显示1g/ml浓度的钩藤使致痫海马脑片诱发场电位幅度明显下降, 幅度平均降低27.64%, 平均8.71 min恢复, 经统计学检验,P0.01, 有显著意义 (图2, 表1) 。 3 胞内钙通道及钩藤碱在癫痫中的作用 本研究显示钩藤对中枢神经系统的突触传递过程有明显的抑制效应, 具有抗癫痫作用。 海马CA1区锥体神经元有着众所周知的Na+电导、K+电导以及Ca2+再生性电导。海马CA3区锥体细胞在去极化过程中不仅产生对TTX敏感的Na+-依赖性波峰还产生高阈值的TTX不敏感的钙依赖性波峰。 在CA3区锥体细胞的Schaffer侧支与CA1区锥体细胞之间的突触为兴奋性突触, 以谷氨酸为递质。当谷氨酸与其海人酸 (KA) 受体、使君子酸 (QA) 受体结合时, 激活Na+通道, 使细胞膜去极化, 当膜电位达到电压依赖性钙通道 (VDCC) 激活的阈电位时, VDCC开放, 细胞外钙内流。谷氨酸与N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受体结合后, 受体门