四氯化碳诱导大鼠肝纤维化与尿激酶型纤溶酶原激活物基因表达的关系.docxVIP

四氯化碳诱导大鼠肝纤维化与尿激酶型纤溶酶原激活物基因表达的关系 骨髓源性肝干（nbsc）来源丰富，生长能力强，外生物质能力强，肝系细胞分工能力强，是治疗肝脏疾病理想的靶细胞。然而,由于迄今尚未发现BDLSC区别于骨髓来源其他干细胞的特征性表面标志,故无法有效地从骨髓细胞中获得纯化的BDLSC。本研究根据肝损伤时肝脏再生的机制,拟从淤胆型肝损伤早期大鼠骨髓提取骨髓细胞,通过体内病理环境的筛选作用后,再经体外淤胆血清和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的筛选、诱导分化及扩增,从而快速、高效地获取BDLSC。 尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator, uPA)在降解纤维和逆转肝纤维化中起重要作用。本研究将携带人uPA基因的腺病毒(adenovirus carrying human uPA cDNA, AduPA)体外转染BDLSC,移植入肝纤维化大鼠体内,评价转基因BDLSC对肝纤维化的疗效,旨在为其临床应用治疗肝纤维化提供理论依据和实践基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 实验动物动物 纯系Fisher 344雄性大鼠10只,雌性大鼠36只,体质量150～180 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,生产许可证号:SCXK(沪)2003-0003;使用许可证号:SYXK(沪)2003-0031。 1.1.2 dmem/fps2基础培养液 TRIzol(Invitrogen),M-MLV逆转录酶(Promega),TaqDNA聚合酶(Takara),DMEM/F12基础培养液含10%胎牛血清(Hyclone),20 mmol/L Hepes、1×10-7mol/L地塞米松、10 mg/L 胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠混合物(insulin-transferrin-sodium selenite media supplement, ITS)、25 μg/L HGF(PeproTech)。 1.2 方法 1.2.1 血清除菌、除菌 将大鼠胆总管结扎10 d后取骨髓细胞前经下腔静脉取血,全血置37 ℃水浴中30 min,离心后吸取上层血清,过滤除菌,56 ℃中灭活30 min,-20 ℃中保存备用。病理条件培养液:将DMEM/F12基础培养液中10%胎牛血清换为5%的自制淤胆血清。 1.2.2 林勇博士惠赠乘子 人pAduPA重组腺病毒质粒由第二军医大学附属长征医院林勇博士惠赠。利用脂质体转染法在293细胞中包装和扩增,用氯化铯梯度离心纯化,AduPA最终病毒滴度可达3×1012pfu/mL。 1.2.3 细胞分离和接种 取胆总管结扎10 d的F344雄性大鼠,乙醚麻醉,背位固定大鼠,常规消毒铺巾,经下腔静脉取血(用于制备淤胆血清)后,无菌解剖双侧股骨和胫骨,去除骨上附着的软组织,离断两端骨骺,用5 mL注射器吸取无血清培养液,反复将骨髓冲出,吹打成单细胞悬液。将收集的细胞悬液缓慢加在1.077 g/cm3的淋巴细胞分离液上部,1 500×g离心30 min,用吸管将分界层细胞吸入至另一无菌离心管中。用PBS洗涤两次,将DMEM/F12基础培养液按2×105/cm2密度接种细胞于T-25 cm2培养瓶中。72 h后首次换液,换为病理条件培养液持续培养,以后每隔3～4 d换液,7～10 d后首次传代。 1.2.4 pcr检测指标 取培养2周的大鼠骨髓细胞以5×105/孔接种于6孔板,培养24 h后收集细胞,用TRIzol试剂提取细胞总RNA。取1 μg细胞总RNA用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链,以2 μL逆转录产物为模板进行PCR扩增。检测白蛋白(albumin,ALB)、甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、细胞色素P450 2B1(cytochrome P450 2B1,CYP2B1)、转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)、肝细胞核因子-1α(hepatocyte nuclear factor-1α,HNF-1α)、肝细胞核因子-3β(he-patocyte nuclear factor,HNF-3β)及白蛋白转录因子CCAAT/增强结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α,C/EBPα)mRNA的表达。各指标引物序列、退火温度、扩增产物长度及PCR反应条件见参考文献。各RT-PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.2.5 体外细胞移植后细胞的检测 将雌性F344大鼠随机分为4组,每组9只。①正常组:皮下注射等量橄榄油。②模型组:予40% CCl4(CCl4∶橄榄油=2∶3,3 mL/kg)皮