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改进质粒dna提取方法的研究 通过传统的碱裂解法提取的细菌物质、物质和盐的产物通常含有大量的蛋白质、盐和其他污染物，提取过程相对复杂。所使用的试剂对人体有害，得率相对较低，试验结果也不稳定。本实验的创新的点在于结合了常规碱裂解法和Mini质粒提取的优点,在工程菌生长至对数期时加入氯霉素抑制细菌蛋白质的合成,但不影响松弛型质粒DNA的复制,为质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除提供了方便,还可以达到提高质粒DNA产量的目的,由于细菌长期受到抑制使裂解液中的黏稠度显著降低,向培养基中添加氯霉素比处理黏稠的裂解液更方便,同时利用LiCl沉淀RNA,并简化操作流程,使提取时间缩短,并且在操作过程中去除了酚、氯仿等对人体有害的试剂,使试验本身对操作者的危害得以降低,从而建立了一套完整、便捷、质粒DNA得率和纯度高、且相对比较安全的大肠菌质粒DNA的提取方法,可直接用于PCR和限制性酶切等分子生物学实验操作。 1 材料和方法 1.1 培养基和仪器 1.1.1 实验材料 E.coliM15为本实验室收藏菌种;质粒pREP4为清华大学赠送、本实验室保存。 1.1.2 实验试剂 1.1.2.1 DNA Marker购自华美公司;其他各种常规化学试剂均为分析纯。 1.1.2.2 氨苄青霉素(Amp):配成50mg/mL水溶液,-20℃保存备用。 1.1.2.3 LB培养基、SolutionⅠ、Solution Ⅱ、Solution Ⅲ、STE、TE配制参见。 1.1.2.4 RNA酶A母液:将RNA酶A溶于10mmol/L Tris-Cl (pH7.5) 15mmol/L NaCl,配成10mg/mL的溶液,于100℃加热15min,使混有的DNA酶失活,冷却后用1.5mL ep管分装保存与-20℃。 1.1.2.5 LiCl(8mol/L):100mL。 1.1.2.6 NH4AC(8mol/L):100mL。 1.1.3 仪器:离心机;PCR仪;凝胶成像系统。 1.1.4 培养基:LB培养基,按《分子克隆实验指南》说明配制。 1.2 重组质粒dna的检测 1.2.1 含重组质粒DNA细胞的培养与收集 将含有质粒CyPA的M15菌种接种在LB固体培养基(含50μg/mL Amp)中,37℃培养12-16h。挑取转化细胞的单菌落,接种到50mL LB液体培养基(含50μg/mL Amp)中,37℃振荡培养约12-16h(当菌液生长到对数期OD600=0.4-0.6在培养液中添加适当体积的34mg/mL的氯霉素,使其终浓度为170μg/mL)。 1.2.2 优化的碱裂解法提取质粒DNA (1)12 000r/min离心30s,收集1.5mL培养物中的菌体,尽量弃尽上清,倒置片刻; (2)将细菌沉淀重新悬浮于1mL用冰预冷的STE中,同上离心(此步可以重复)。 (3)加入100μl溶液Ⅰ,在涡旋器上使菌体充分重悬;或用微量移液器混匀; (4)加入200μl溶液Ⅱ,立即将离心管缓慢颠倒数3-5次直到溶液变澄清,冰浴2min; (5)加入150μl溶液Ⅲ,缓慢颠倒离心管3-5次直至白色絮状物充分形成,冰浴2min; (6)12 000r/min离心2min后将上清转入另一管中,加入2V的800μl 95%乙醇,混匀,静止5min,12 000r/min离心3min;弃上清。 (7)加入200μl TE溶解沉淀,然后再加入100μl冰预冷的8mol/ LiCl溶液和100μL冰预冷的8mol/L的NH4AC,冰浴10min后12 000r/min离心3min,使RNA和大量蛋白质杂质沉淀; (8)取上清,加入RNA酶A母液,使得最终RNA浓度为20μg/mL,37℃保温5-10min。 (9) 加入2倍体积的95%乙醇,混匀,静止5min,12 000r/min离心3min;弃上清。70%乙醇洗涤后12 000r/min离心2min;弃上清,置于37℃培养箱干燥5min,用30μl的TE溶解DNA沉淀, -20℃保存备用; (10)取适量质粒DNA用于分光光度计定量。 1.2.3 重组质粒DNA的电泳检测 制备0.8%琼脂糖凝胶,取1μl样品进行凝胶电泳检测。以传统的碱裂解方法所提的质粒DNA做对照。 1.2.4 重组质粒DNA的限制性核酸内切酶检测 酶切方法见《分子克隆实验指南》第三版。 1.2.5 质粒DNA的定量及杂质检测 采用分光光度计法,样品稀释100倍后,分别测定OD260和OD280值,若OD260/OD2801.8,表明DNA中含有RNA杂质;若OD260/OD2801.6,表明样品中含有蛋白质等杂质;OD260=1.0时,相当50μg/mL的DNA。 1.2.6 重组质粒DNA的PCR检测 按以下次序,将各成分加在0.5mL灭菌扩增管中混