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不同ph对猪肉肌原纤维蛋白二级结构的影响 0 猪肉肌原纤维蛋白与ph的相互作用关系 【研究意义】肌肉原纤维素是肌肉中具有重要生物学功能的盐溶性蛋白质，主要由肌球蛋白、肌动蛋白、肌动球蛋白和调节蛋白（原肌球蛋白和肌钙蛋白）组成。它对肉类的功能特性（如硬度、保水、质地等）具有密切的关系。蛋白质的生物功能取决于其特定的三维结构(二级结构)。肌原纤维蛋白热不可逆凝胶形成过程中,蛋白质发生变性聚集,其实质是蛋白质分子中的次级键被破坏,引起蛋白质天然结构解体,其二级结构发生一定变化,而所制凝胶呈现一定的保水性、质构特性(硬度等)以及一定的微观结构,其两者间可能具有一定相关性。【前人研究进展】圆二色(circular dichroism,CD)是一种简单和快捷的获得生物大分子结构的手段。圆二色现象是由光学活性物质对左右圆偏振光的吸光率之差引起的。蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的,其主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫键。其CD谱远紫外区段(190—250 nm),主要生色团是肽链,这一波长范围的CD谱包含着生物大分子主链构象的信息;在近紫外区(250—300 nm),占支配地位的生色团是芳香胺基侧链,这一区域可以给出“局域”侧链间相互作用的信息。根据所测蛋白质或多肽的远紫外CD谱,能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息,从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。在CD谱上,α-螺旋结构在靠近192 nm有一正的谱带,在222和208 nm处表现出两个负的肩峰谱带,是α-螺旋结构的特征峰,通过峰值的改变可以看出α-螺旋结构的变化。圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的方法,要求蛋白浓度比较低,而蛋白凝胶形成需要有比较高的浓度,然而Choi和Ma同时利用圆二色谱和拉曼光谱研究普通荞麦中球蛋白的构象,前者取较低的蛋白浓度(0.01%),后者取较高的蛋白浓度(5%),结果发现利用圆二色谱与拉曼光谱所测得的结果相一致。【本研究切入点】p H能影响凝胶形成过程中蛋白质之间的变化,通过改变氨基酸侧链电荷分布,降低或增加蛋白质和蛋白质相互作用,从而对蛋白结构和凝胶功能性质产生影响。在蛋白质天然二级结构中,α-螺旋占主要地位,本试验主要是用圆二色谱测定猪肉肌原纤维蛋白随p H变化时,其二级结构α-螺旋的变化,同时测定相应p H条件下,肌原纤维蛋白热诱导凝胶所呈现的质构、保水性及微观结构,确定其相互关系。目前国内尚未见关于肌原纤维蛋白在此方面研究的报道。【拟解决的关键问题】探讨肌原纤维蛋白二级结构(α-螺旋)含量变化,与其热诱导凝胶质构(硬度)、保水性和电镜微观结构相关关系,找出α-螺旋与凝胶功能特性间的关系,以利于更好地了解其凝胶机制,为以后开发高品质凝胶肉制品提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 蛋白质提取法 猪肉腰大肌:购于南京苜蓿园大街农贸市场,剔除可见结缔组织和脂肪,切碎,真空包装,贮存于-20℃直到蛋白质提取。 所用试剂最低纯度为分析纯。 1.2 仪器和检测方法 圆二色谱仪:J-810,日本JASCO公司;落地式高效冷冻离心机:Avanti J-E,美国Beckman Coulter公司;物性测试仪:TA.XT2i,英国Stable Micro Systems公司;扫描电镜:S-3000N,日本Hitachi公司;高速组织打碎机:Waring Blender 8010ES,美国Waring公司;高速匀浆机:Ultra Turrax T25 BASIS,德国IKA公司;p H计:HANNA,葡萄牙;紫外分光光度计:UV-2450,日本岛津公司。 1.3 测试方法 1.3.1 从肌肉原磷脂酸中提取蛋白质 肌原纤维蛋白的提取参照韩敏义的方法。所得肌原纤维蛋白质浓度用双缩脲法测定,以牛血清蛋白作标准曲线,计算蛋白质浓度。 1.3.2 蛋白凝胶的制备 用磷酸缓冲液(0.6 mol·L-1Na Cl,50 mmol·L-1Na2HPO4/Na H2PO4,p H 6.0)将肌原纤维蛋白浓度分别调整到0.08 mg·m L-1和40 mg·m L-1,并且将整体离子强度调整到0.6 mol·L-1Na Cl,用1 mol·L-1HCl或Na OH将蛋白样品的p H分别调整到5.0、5.5、6.0、6.5和7.0,其中0.08 mg·m L-1样品用于圆二色谱α-螺旋的测定,40 mg·m L-1样品置于于水浴锅以大约1℃/min速率从20—70℃线性升温,而后在70℃保温20 min形成凝胶,于4℃冷库冷却过夜,进行质构、保水性测定和电镜拍摄。 1.3.3 蛋白含量测定 将制备好的肌原纤维蛋白样品装于光路长度为0.1 cm的样品槽,扫描波段为190—250 nm,扫描速度为100 nm/min,利用水浴锅将样品线性升温加热到80℃,保温20