海南岛东部古菌16srrna基因的克隆及其系统发育学分析.docxVIP

海南岛东部古菌16srrna基因的克隆及其系统发育学分析 海洋约占地球表面的71%，大部分海底被海洋沉积物覆盖。随着对海洋研究的深入,人类逐渐意识到海洋在全球物质循环和能量流动中的重要地位。海洋沉积物是海洋的最主要组成部分之一,它是地球岩石圈和生物圈之间各元素生物地球化学循环过程的中枢。据估计,海洋沉积物所蕴含的生物量至少占到地球总生物量的1/10~1/3。自从在海洋环境中发现丰富的海洋古细菌,人们在生物圈的多个生境发现古菌的踪影,促使人们改变以往的古菌只存在于极端环境的观点,古菌分布的广泛性得到普遍的共识。由于古菌细胞外壳较细菌细胞更难于破解,古菌细胞内16S核糖体RNA基因拷贝数低于细菌等诸多因素影响,通常导致对古菌定量分析造成较大偏差。最近,Julius在全球海洋范围内的多个站位采集沉积物样品,以细胞膜磷脂类大分子为生物分子标记物,采用的定量PCR和探针杂交为辅助手段,证明古菌生物量占总沉积物原核生物量的绝大部分。 赋存于环境条件复杂的海底生境,致使海洋古菌结构和功能表现出复杂的多样性。只有全面了解古菌的多样性,才能理解古菌在生命进化过程的地位和各种元素生命地球化学循环过程中的作用。目前,可以培养的古菌种类稀少,非培养的分子生物学方法是研究古菌多样性最主要的手段。原核生物16S r RNA基因所具有的特性,使之成为系统发育分析天然的标签。16S r RNA基因克隆文库、荧光原位杂交(FISH)以及变性梯度凝胶电泳(DGGE)是目前研究微生物多样性比较普遍的方法。FISH技术操作相对比较简单高效,其局限性是受数据库已知序列影响比较大。16S r RNA基因克隆文库和DGGE方法在PCR的扩增的过程中出现部分偏差,但这并不影响它们作为研究环境微生物多样性最重要的手段。 作者构建海南岛东南部近岸沉积物样品的古菌16S r RNA基因文库和系统发育树来分析该样品古菌的多样性。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 格氏原螯虾样品的采集 2007年8月南海北部海洋观测开放航次的抓斗取样,采自海南岛东部近岸的501站位(18°59.995′N,110°41.835′E),水深74 m,沉积物为黑色的砂质样品,采集后-20°C保存。 1.1.2 takara测定 PCR扩增仪(BIO-RAD),DNA回收纯化试剂盒(TAKARA),电泳仪(广州正一),内切酶(TAKARA),凝胶成像仪(BIO-RAD),PMD18-T(TAKARA),感受态DH5α(TAKARA)。 1.2 专酸钠ctab 沉积物总DNA的提取,在Zhou的文献提供的方法基础上加以改进,本文具体方法为:取2 g沉积物样品,加入6 m L DNA提取缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl(p H8.0),100 mmol/L Na2-EDTA(p H8.0),1.5mol/L Na Cl,0.5%CTAB,1%PVPP,100 mmol/L Na3PO4和200 mg/L蛋白酶K],涡旋3 min后,在摇床水浴振荡30 min(37℃,225 r/min),加入溶菌酶(终质量浓度1 g/L)后振荡30 min,然后加入1 m L 20%SDS和该提取液体积100 mg/L浓度的蛋白酶K,经60℃水浴300 min,6 000 g离心10 min,将上清液移入新的离心管。沉淀重复抽提2次,收集3次上清液于同一离心管中,加入等体积的酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1)混匀,9 000 g离心25 min,将上层水相移入新的离心管,再加入等体积氯仿︰异戊醇(24︰1),9000 g离心25 min,将上层水相移入新的离心管。加入0.6倍体积异丙醇,于-20℃沉淀60 min。在4℃,9 000 g离心25 min,弃上清,沉淀用70%的乙醇洗两次,吹干。溶解于100μL TE溶液。琼脂糖电泳切胶回收,试剂盒纯化。 1.3 tt-3pcr反应体系 采用古菌通用引物21F:5′-TTCCGGTTGATC-CYGCCGGA-3′和958R:5′-YCCGGCGTTGAMTCC-AATT-3′。50μL PCR反应体系:25μL Extaq(Takara),顺反引物各2μL,模板1μL,用双蒸水补足至50μL。PCR条件:95℃3 min,94℃30 s,55℃45 s,72℃1 min,25个循环,72℃延伸10 min。扩增完毕后采用Reconditioning PCR:取十分之一的16S r RNA基因PCR产物为模板,用与上次PCR扩增相同的反应体系进行3个循环扩增。 1.41 阳性克隆子的筛选 将Reconditioning PCR得到的扩增产物克隆到T-Vector,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞里,进行蓝白斑筛选,通过菌落PCR的方法筛选阳性克隆子。