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胶原模拟多肽三螺旋结构的研究 特定序列设计 天然胶的原因具有良好的生物适应性和可分解性，因此在生物材料领域进行了广泛的研究和应用，如组织结构、可吸收调整等。胶原具有独特的三螺旋结构,这与胶原的稳定性及与细胞识别等多种生物学活性密切相关。但胶原结构复杂、功能域众多、分子量大且较难制成溶液,这一定程度上限制了对胶原的进一步研究。 胶原模拟多肽(collagen mimetic peptide,CMP)是指一类依据胶原一级结构的特定序列设计,可模拟天然胶原部分特征结构、生物学活性的多肽,也可作为一种分子模型,用于研究胶原特征结构及胶原特定序列的功能。研究较多的一类是Pro-Hyp-Gly (POG)重复片段,这类多肽可形成类似天然胶原的三螺旋结构,另一类是胶原与整合素的作用片段Gly-PheHyp-Gly-Glu-Arg(GFOGER),相关研究显示整合素能够识别胶原肽链的某一片段,但这种识别作用依赖于胶原三螺旋构象的存在。 圆二色谱(circular dichroism,CD)是用于测定具有手性结构、能产生左右旋光差异性吸收的化合物结构,主要用于测定分子结构不对称性的光谱学方法。一般生物大分子中均含有手性的基团和结构,因而CD常用来测量和观察生物大分子的结构和构象的变化。胶原和CMP三螺旋结构的CD特征一般是在225 nm附近有一个正吸收峰,在197 nm附近有一个负吸收峰,吸收峰的位置随着氨基酸序列和长度的变化会发生偏移。因此,CD谱可用来研究胶原和CMP三螺旋结构及其热变性过程。 根据胶原特征重复序列(POG)n及胶原上α2β1整合素识别位点GFOGER设计不同序列或长度的CMP,通过CD谱研究其三螺旋结构、热稳定性等随序列或长度的改变所发生的规律性变化,为进一步研究胶原与CMP分子特征性的三螺旋结构形成规律及其用作生物材料奠定基础。 1 实验部分 1.1 多肽的合成及hplc扩增 圆二色谱仪:J-815(日本JASCO公司)。胶原模拟多肽长度与序列见表1,其中GFOGER为Ⅰ型胶原的整合素识别序列(binding sequence,BS)。所有多肽均为作者设计,上海吉尔公司代为合成,HPLC检测纯度90%。所有水溶液均用MilliQ-biocel系统过滤后配制。 1.2 cmp的初始稳定性 配制0.3 mg·mL-1的五种CMP水溶液,于4℃静置平衡48 h;分别将其注入厚度为1mm的石英样品池,用圆二色谱仪常温下进行样品的CD测试。各参数设置如下:扫描波长范围190～260 nm,带宽1 nm,分辨率0.1 nm,扫描速度100 nm·min-1,累计扫描3次。将CD值换算成氨基酸残基平均摩尔椭圆度(mean residue ellipticity,MRE,[θ])来表示CMP的圆二光谱吸收值。 其中,θ为椭圆率(mdeg),1为石英池厚度(mm),c为CMP溶液浓度(mg·mL-1),M为CMP分子摩尔质量(g·mol-1),nr为CMP中氨基酸个数。 1.3 变性温度测试 配制0.3 mg·mL-1的五种CMP水溶液,于4℃静置平衡48 h;分别将其注入厚度为1mm的石英样品池,用CD仪进行变温扫描。温度范围10～70℃,升温速度20℃·h-1,每5℃扫描一次共测试13个温度点,扫描波长范围190～260 nm,扫描前每个温度点平衡15 min,其他参数参考室温CD测试。由CD值计算[θ]值,并根据λ=225 nm处的[θ]值作图,可确定CMP的变性温度(Tm)。 五种CMP溶液测试完变性图谱后,在70℃平衡30 min使其充分变性。参照升温过程的CD测试方法,进行降温复性测试。同样计算λ=225 nm处的[θ]值作图,得复性圆二色谱图。 2 结果与讨论 2.1 最大吸收峰的确定 五种CMP溶液室温CD谱图及相关信息如图1、表2所示。每种CMP在波长190～260 nm范围内均有正负吸收峰,最大正、负吸收峰(MRE极值点)分别处在222～225 nm和197～200nm范围内,吸收值与X轴的交叉点(MRE≈0处)均在在218 nm附近。表明设计合成的五种CMP室温下均可自组装形成有类似于胶原的特征性三螺旋结构。 2.2 温度突变时cmp的热变性 CMP的热稳定性一般用解链温度TM来衡量。Tm值越大,三螺旋结构越难解旋成α单链,说明CMP的热稳定性越好;相反,Tm仇越小,三螺旋结构越易解旋为α单链,则CMP热稳定性越差。Tm值一般可由CD热变性曲线突变区间计算获得,其值与样品浓度和加热时间有关,所以在相同条件下测试比较才有意义,但许多研究者往往忽略了浓度的影响,本实验每个样品的浓度和实验条件均一致。 图2为五种不同CMP圆二色谱曲线随温度升高的变化趋势图(10～70℃,每隔5℃作一条曲线)。可以看出,随着温度的升高其正