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牙周袋龈下菌斑中古细菌分布的基因组学分析 每周疾病是由微生物引起的感染疾病。牙菌斑的研究一直是口腔医学领域的研究热点。目前已知牙菌斑中生存着超过600种的微生物物种。依赖实验室培养技术的传统微生物学研究方法,对于其中的苛养细菌和未知培养方法的微生物,往往无能为力。因此牙菌斑中半数以上的微生物由于未获培养而不为人们所了解,严重地局限了人们对牙菌斑微生物的全面认识,而未知的牙周病病原微生物可能涵盖真菌、病毒、未获培养的细菌和古细菌等众多微生物。 古细菌又称古菌(Archaea,旧称Archaeobacteria),广泛分布于高温、高酸碱度、高盐浓度、严格无氧状态等各种极端自然环境中。针对古细菌的医学研究相当有限,因此古细菌与人类疾病的关系非常模糊。虽然近来的研究已经证实人体内的许多环境是适合古细菌生存的,但还没有确凿的证据证实古细菌与人类疾病的因果关系,在牙周病学领域的研究更少。 本研究使用非培养依赖的分子生物学技术,以获取龈下菌斑中古细菌分布的基线信息,为探索古细菌与牙周疾病的相关性奠定基础。 1 对象和方法 1.1 测量不同深度牙周袋的虾下菌斑标本的采集 经知情同意,由牙周科门诊随机入选牙周炎和牙龈炎患者作为采样对象,采集不同深度牙周袋(龈袋)的龈下菌斑标本。被采集标本的患者均否认有系统性疾病史,均否认3月内有服用抗生素史,女性患者均否认妊娠。 1.2 离心管菌斑的采集 在临床治疗前,检查记录患者基本信息。随机选择标本采集位点,记录采集位点的牙周袋或龈袋探诊深度(probe depth,PD)等检查资料,刮除龈上菌斑,使用无菌Gracey刮治器刮取龈下菌斑,立即转入含0.3 mL PBS的离心管中,使用电子天平检测离心管质量变化,计算采集到的菌斑数量,振荡5 min,从中抽取含有1 mg菌斑的液体至一新的无菌离心管,-20 ℃冻存。 1.3 各组pd2mm 依据上述临床数据将牙周袋位点按照PD分为A组(PD≤2 mm,n=13)、B组 (PD=3～4 mm,n=15)、C组(PD=5～6 mm,n=19)和D组(PD≥6 mm,n=22)。 1.4 离心除杂与澄清 收集得到的标本加入0.3 mL DNAzol (Invitrogen),振荡1 min,10 000×g离心10 min,吸取上清液至新管中,加入无水乙醇0.15 mL,振荡混合后静置3 min,4 000×g离心2 min,弃上清。加入0.3 mL 75%乙醇洗涤2遍。弃上清后静置2 min,加入0.2 mL 8 mmol/L NaOH溶液振荡溶解DNA。 1.5 反应条件及pcr扩增能力nf ①设计合成引物: 引物1:AGCRRGAGCCCGGAGATGG;引物2: CGGCGTTGARTCCAATTAAAC。②PCR反应体系(20 μL):10×PCR缓冲液2.5 μL,Mg2+终浓度1.5 mmol/L,10 mmol/L dNTP0.5μL,5 U/μL Ex Taq (Takara) 0.1 μL,25 mmol/L引物各0.25 μL,模板1 μL,去离子水加至20 μL。③PCR仪(Biometra)设定反应条件:95 ℃预变性60 s;95 ℃变性15 s、64 ℃退火30 s,40个循环;附加72 ℃延伸7 min。④扩增产物获得:扩增产物使用含0.5 μg/mL 溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶电泳40 min(恒压6 V/cm),紫外灯观察目标片段,记录标本的阳性结果。 1.6 单菌落的制备 古细菌通用引物PCR产物为多种序列混合物,使用TA克隆和序列分析进行验证。应用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Takara)回收纯化1个标本的PCR产物,取1 μL回收DNA片段,加入pMD18-T质粒1 μL、去离子水3 μL、Ligation Mix试剂5 μL,16 ℃反应30 min。加入100 μL DH5α感受态细胞中,冰中放置30 min,42 ℃加热45 s,再在冰中放置1 min。随后加入890 μL SOC培养液,37 ℃ 220 r/min振荡培养60 min。取100 μL铺于含1 mg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上,无菌L棒涂布均匀,37 ℃孵育24 h,随机挑取形成的单菌落25个,接种LB液体培养基,37 ℃振荡培养24 h。以菌液为模板重复上述PCR检测,将阳性的23个菌液标本送商业公司使用M13引物进行测序,结果序列使用NCBI提供的Blast以及核糖体数据库RDP-Ⅱ的 功能进行分析和验证,并使用MEGA3软件构建Neighbor-joining系统发育树,参数bootstrap为500次重复,对测序结果进行系统发育分析。 1.7 统计方法 计算各组的古细菌检出率。采用χ2检验进行统计学分析。 2 n-fmoc3系统发