响应面法优化枯草芽孢杆菌发酵条件及其产果胶酶条件.docxVIP

响应面法优化枯草芽孢杆菌发酵条件及其产果胶酶条件 果实凝胶酶是一种常见的分解果胶物质的酶，包括半乳液酶（pg）、果胶分解酶（pl）和果皮酯酶（pe）。果胶的完全降解需要多种酶协同作用,内切聚半乳糖醛酸酶(endo-polygalacturonase,EC.3.2.1.15)作用于果胶主链内部的α-1,4糖苷键,是果胶最关键的水解酶之一,也是果胶酶中最早被人们所认识和应用最广泛的一类,因此最先常被称为果胶酶。 果胶酶作为一种绿色安全的酶制剂在饲料工业和畜牧业中应用前景广阔。果胶经内切聚半乳糖醛酸酶特异性水解所得的产物为聚合度不等果胶低聚糖(POS,DP:2-10)。POS是公认的功能性饲料、食品添加剂,其具有特异性增殖双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌,调节和恢复肠道内微生态菌群的平衡,抑制肠内有害菌及病原菌的繁殖,促进肠蠕动防止便秘及下痢;可增进微量元素的吸收和维生素的合成、提高机体免疫力;同时POS能被双歧杆菌分解产生丙酸可抑制肝脏中葡萄糖转化为脂肪,具有降血脂、降胆固醇,不提高血糖值的生理功效。POS作为饲料添加剂,可替代或减少动物饲养过程中抗生素的使用,提高畜禽健康水平和饲料转化效率,生产绿色、安全、高品质的肉蛋奶产品,同时降低致病菌的抗药性。 本研究筛选出产胞外果胶酶的菌株,对其进行鉴定,并采用响应面法优化其发酵条件,系统研究其酶学性质,有助于获得适用于饲料添加剂和制备POS的果胶酶,并为开展果胶酶基因工程菌等方面研究提供材料。 1 材料和方法 1.1 样品来自浙江省衢州、台州、秀水、永康和临海的柑橘花园，采用当地样品进行采集，4c下储存 1.2 试剂和pcr 果胶(Pectin,from citrus fruits)、琼脂糖和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma,D-(+)-半乳糖醛酸购自Fluka,PCR kit购自上海生物工程有限公司,16S r DNA序列扩增引物由上海生物工程有限公司合成,蛋白胨和酵母膏购自Difco,其他试剂为国产分析纯级。 1.3 培养基 1.3.1 固碳培养基 1.3.2 kh2po1 果胶1.0 g,(NH4)2SO40.2 g,KH2PO40.2 g,Mg SO4·7H2O 0.02 g,调p H至中性,琼脂2.0 g,蒸馏水100 m L,灭菌,倾倒平板。 1.4 方法 1.4.1 菌株的筛选 分别取采集的土样溶解到生理盐水中,静置2 h,取上清接种到LB培养基中进行富集,37℃,120 r/min培养24 h;培养产物分别稀释到10-3、10-5、10-7并涂布于筛选平板上,37℃培养48 h;挑取经刚果红染色产生较大透明圈的单菌落至发酵培养基中,经37℃,150 r/min培养24 h,选取果胶酶活性最高的菌株JLSP-13作鉴定。菌株鉴定的生理生化试验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)进行。 1.4.2 16srdna序列的pcr扩增和序列分析 1.5 jlsp-13促进果实发育和葡萄酶单因素试验 JLSP-13以LB培养基为基础培养,通过单因素实验,研究添加碳源可溶性淀粉浓度、诱导物果胶浓度和发酵时间对其产果胶酶的影响。 1.6 胶的浓度及浓度 选取对单因素实验中对JLSP-13产酶性能有促进作用的因子,采用二次回归正交旋转组合设计模型,以发酵时间,添加可溶性淀粉、果胶的浓度为自变量,分别用X1、X2和X3来表示,按方程xi=(Xi-X0)/△X对自变量进行编码(表2),式中,xi为自变量的编码值,Xi为自变量的真实值,X0为实验中心点自变量的真实值,△X为自变量的变化步长,果胶酶产量Y为响应值。采用SAS 9.0对实验数据进行回归拟和并对拟和方程作显著性检验及方差分析,利用Matlab 6.5(Math Works,USA)作响应面。 1.7 干草芽bga的酶学性质 1.7.1 蛋白质浓度测定 果胶酶活性测定采用DNS法,活力单位(U)定义为在最适反应条件下,以每1 min生成1μmol还原糖(以D-半乳糖醛酸计)所需的酶量作为一个酶活力单位。蛋白质浓度的测定采用Bradford法,牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白。采用双倒数作图法求米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)。 1.7.2 温度对bpga活性的影响及其稳定性 1.7.3 ph的确定 果胶底物分别用p H 3.0~9.0的缓冲液配制,测定果胶酶活性,确定其最适p H。将果胶酶液p H分别调为p H3.0~9.0,在25℃条件下保温1 h,然后在最适条件下(60℃、p H 6.0)测定酶活,计算酶的存活率。 1.7.4 黏度的变化 以400 m L 4.0%的果胶为底物,添加110 U果胶酶,在28℃下反应,采用DV-I Prime(Brookfield)黏度计测定反应体系的黏度变化,选用S-02号转子,100