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股骨颈骨折后股骨头内骨细胞凋亡及bcl-2表达的关系 股骨颈骨折是一种常见的骨损伤。主要并发症是骨折不全和股骨头坏死，其中股骨头坏死风险高。笔者运用免疫组化技术对股骨颈骨折患者30 d以内股骨头标本分组进行Bcl-2检测, 并进行组织形态学观察, 同时采用原位末端标记 (TUNEL) 法检测骨细胞的凋亡情况, 探讨股骨颈骨折后股骨头内骨细胞凋亡对股骨头坏死的影响及其病理机制。 1 临床数据和方法 1.1 骨折时间和性别分布 患者共60例, 其中男19例, 女41例;年龄50～70岁, 平均65.7岁。排除肿瘤性疾病和长期卧床患者。骨折均为外伤所致, 均在骨折后30 d以内。据骨折时间长短分为早、中、晚期组:早期组 (3～10 d) , 男5例, 女15例;中期组 (10～20 d) , 男8例, 女12例;晚期组 (20～30 d) , 男6例, 女14例。 1.2 空骨陷窝所占比例的确定 股骨头负重区沿冠状面剖开, 冠状面切取2 mm厚组织做石蜡切片, 用40 g/L多聚甲醛 (pH=7.2) , 100 g/L 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA) Tris-HCl脱钙, 多聚赖氨酸处理玻片做HE染色, 切片上随机计数100个骨细胞计算空骨陷窝所占百分比。 1.3 抗人单克隆抗体 标本5 μm石蜡切片, 多聚赖氨酸处理玻片做PV-9000免疫组化染色, 具体步骤参照试剂盒说明进行。Bcl-2鼠抗人单克隆抗体及PV-9000试剂盒均为北京中山公司产品。用已知阳性切片作为阳性对照, 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替一抗作为阴性对照。二甲基联苯胺 (DAB) 染色, 苏木素对比染色。Bcl-2表现为细胞浆阳性。判断标准:阳性细胞表达数1%为阴性 (-) , 1%～5%为 (+) , 6%～25%为 (++) , ≥25%为 (+++) 。 1.4 阳性细胞的检测 采用TUNEL法, 试剂盒购自北京中山公司, 实验步骤参照说明书。试验设阳性与阴性对照, 当胞核出现黄色颗粒为阳性细胞 (即凋亡细胞) 。结果观察:每张玻片随机选择10个区域, 每个区域计数50个骨细胞, 统计出凋亡细胞数, 即为每500个细胞中的细胞凋亡数。 1.5 患者股骨空骨陷窝计数及凋亡细胞计数 采用SPSS 10.0统计软件包进行数据处理, 不同组别股骨头空骨陷窝计数及凋亡细胞计数以xˉ±sxˉ±s表示, 采用t检验;免疫组化染色表达采用等级分组资料H检验。 2 结果 2.1 骨细胞消失或凋亡 各组股骨头外观正常。早期组大部分股骨头软骨下呈缺血坏死改变, 髓腔内各种细胞消失, 大部分骨细胞胞核消失, 骨陷窝空虚, 仍可见部分残存的骨细胞, 骨小梁形态大致正常。中期组骨细胞绝大部分胞核消失, 骨陷窝空虚化, 骨小梁部分吸收, 可见少量新生血管。晚期组骨细胞胞核均消失, 仅见空骨陷窝 (图1) , 部分骨小梁边缘可见成骨细胞及新生血管。在不同组中均可见到凋亡的骨细胞, 其特征是核固缩、染色质深染浓集、核碎裂, 形成凋亡小体 (图2) 。不同时间股骨头骨细胞空骨陷窝计数结果见表1。 2.2 免疫组化的结果 Bcl-2在各组标本中均见表达, 但以中期组表达明显 (图3) , 结果见表2。 TUNEL法检测凋亡细胞结果见图4、表3。 3 骨髓松茸与细胞凋亡 股骨颈骨折是一种常见的骨损伤, 其主要的并发症是骨折不愈合和股骨头坏死。由于现代股骨颈骨折复位固定技术的进展, 骨折不愈合率已明显降低, 而股骨头坏死率仍然很高。细胞凋亡是细胞死亡的两种方式之一。它与细胞坏死不同, 具有特征性的形态改变和生化改变。老年人股骨颈骨折与骨质疏松有关, 而骨质疏松本身与骨内细胞凋亡又有着密切联系, 骨内细胞包括成骨细胞、破骨细胞和骨细胞。近年来研究表明, 骨质疏松发生的骨内细胞凋亡主要发生在成骨细胞, 而骨细胞凋亡发生率较低。因此, 笔者观察主要集中在骨细胞凋亡方面。细胞凋亡受多种基因调控, 在哺乳动物中bcl-2基因及其相关蛋白在细胞凋亡调控中起重要作用, 可以增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性, 抑制细胞凋亡, 是一种凋亡抑制基因, 有人称之为长寿基因。 3.1 骨细胞凋亡的表现 本研究标本均为股骨颈骨折后30 d以内, 组织学观察有不同程度的空骨陷窝形成, 意味着出现了骨细胞的死亡, 并随着时间的发展而加重。在不同组中均可见到凋亡的骨细胞, 其特征是核固缩, 染色质深染浓集, 核碎裂, 形成凋亡小体。Dunstan等发现, 部分骨细胞在骨陷窝中消失的现象可以增加老年髋部骨折个体股骨头内骨小梁数量, 推测可能与骨细胞凋亡有关。TUNEL法测定细胞凋亡也表明, 中期组细胞凋亡较晚期组少。随着骨折后时间延长, 晚期组出现不同程度的修复。在此过程中既有骨细胞凋亡所致骨吸收, 又有成骨细胞增生