蛋白质对宣汉黄牛瘤胃固相黏附纤维降解微生物数量的影响.docxVIP

蛋白质对宣汉黄牛瘤胃固相黏附纤维降解微生物数量的影响 蛋白质饲料是反刍动物饲料中最重要的氮来源。然而，中国的蛋白质资源非常稀缺。预计2020年中国的蛋白质供应不足0.48亿吨。高效合理地利用蛋白质饲料资源可在一定程度上缓解蛋白质饲料资源紧张的局面。反刍动物是主要的粗饲料利用者, 其饲粮主要依靠瘤胃微生物来消化, 瘤胃中存在的细菌、真菌及原虫均具有分解利用纤维物质的能力, 在纤维物质的分解利用过程中细菌和真菌发挥了80%的作用, 原虫起平衡控制作用。产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是3种主要的瘤胃纤维素分解菌。调控瘤胃微生物是提高饲料的利用率、缓解蛋白质饲料资源短缺、提高经济效益的有效途径之一。而前人对瘤胃微生物的研究中, 在饲粮方面主要是针对精粗比和粗饲料不同的研究, 对精料中蛋白质饲料不同对瘤胃纤维降解微生物的影响方面的研究较少。瘤胃微生物在瘤胃内主要是存在于瘤胃液、附着于瘤胃内壁上和黏附于饲料颗粒上。大量研究表明, 瘤胃固相微生物数量高于瘤胃液, 是瘤胃中主要的功能微生物。因此, 研究不同蛋白质饲料对宣汉黄牛瘤胃固相黏附纤维降解微生物的影响显得非常重要。豆粕、菜籽粕和棉籽粕是我国经常使用的植物性蛋白质饲料。本试验选用这3种蛋白质饲料等量替代基础饲粮中15%精料来饲喂宣汉黄牛, 研究瘤胃固相黏附纤维降解微生物数量的变化, 旨在为更好地调控瘤胃微生物, 提高饲料的利用率提供一定的参考。 1 材料和方法 1.1 dna分子质量 菜籽粕、棉籽粕、豆粕及其他饲料原料均来自四川农业大学动物营养研究所试验基地;TIANamp Stool DNA Kit、RNase A (100 mg/m L) 、DNA分子质量标准、6×DNA上样缓冲液、DNase/RNase-free dd H2O、SuperReal Pre M ix Plus (SYBR Green) 均购自TIANGEN (北京) 公司。主要设备有荧光定量PCR仪 (CFX96TM, 美国Bio-Rad) 、凝胶成像系统 (美国Syngene) 、核酸蛋白检测仪 (DU-800, 美国Beckman) 。 1.2 基础饲粮组成及营养水平 选用四川农业大学动物营养研究所试验基地4头体况良好, 装有永久性瘤胃瘘管的4岁去势宣汉黄牛[平均体重 (455.45±18.93) kg]。采用4×4的拉丁方设计, 共4期, 每期10 d (预饲7 d, 采样3 d) 。基础饲粮参考我国《肉牛饲养标准》 (NY/T815—2004) 设计, 1.3倍维持需要, 精粗比为4∶6, 基础饲粮组成及营养水平见表1, 基础组饲喂基础饲粮。试验组分别饲喂以豆粕 (豆粕组) 、棉籽粕 (棉籽粕组) 和菜籽粕 (菜籽粕组) 等量替换基础饲粮中的精料 (替换比例为基础饲粮的15%) 的试验饲粮, 其营养水平见表2。基础组、豆粕组、菜籽粕组和棉籽粕组每头牛饲喂量分别为7.35、6.93、7.19和6.99 kg/d (干物质基础) , 平均分成2次定时 (07:00和17:00) 定量饲喂, 拴系饲养, 自由饮水。 参考张丽英的方法测定饲粮干物质 (DM) 和粗蛋白质 (CP) 含量。按照Van Soest等的方法测定饲粮中性洗涤纤维 (NDF) 、酸性洗涤纤维 (ADF) 和酸性洗涤木质素 (ADL) 含量。采用高锰酸钾法间接测定饲粮钙 (Ca) 含量, 采用钼酸盐法测定饲粮总磷 (TP) 含量。 1.3 单次摄食时间,第3天12:24 3 d采样时间分别为第1天08:00和14:00, 第2天10:00和16:00, 第3天12:00, 即采食后1、3、5、7和9 h。在每头牛的瘤胃内分别取上、下、左、右、中5个位置的瘤胃内容物约200 g, 并用4层纱布过滤分离出固相样品, 装入无菌封口袋中, 样品于-80℃保存备用。 1.4 指标和方法的测量 1.4.1 总dna的提取 将瘤胃固相样品4℃解冻后, 参考Kang等和Laure等的方法洗脱固相黏附微生物。取1 g样品于灭菌10 m L离心管中, 加入5 m L磷酸盐缓冲液悬浮, 混匀30 s, 350×g室温离心15 min, 取上清于一新的灭菌离心管。再向残渣部分加入4 m L厌氧条件下制备的0.15% (V/V) 吐温80, 充分混匀后在冰上放置2.5 h, 350×g室温离心15 min, 取上清于前一离心管, 10 000×g 4℃离心20 min, 去上清留沉淀。然后使用TIANamp Stool DNA Kit试剂盒提取微生物总DNA。用核酸蛋白检测仪测定提取的总DNA的浓度及OD260 nm/OD280 nm。于-20℃保存。 1.4.2 荧光强度的检测 采用荧光定量PCR技术测定各组饲喂后1、3、5、7和9 h宣汉黄牛瘤胃固相黏