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lr2、lr4和lr9在大鼠结肠炎模型结肠组织中的表达 样本受体（tr）是一个天然免疫系统的膜受体。它可以与病因学相关的分子结合，开始信息转化，然后生成序列因子（nf）引起b国激活，并引起炎症介质的出现。因此，它是天然免疫和得少性免疫的联系，可以在一些革兰氏疾病中发挥重要作用。本实验通过观察大鼠结肠炎模型结肠组织中TLR2、TLR4和TLR9的表达,并结合疾病活动度、大体损伤评分、组织学评分和超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性进行分析,旨在探讨三者在炎症性肠病(IBD)发病机制中的作用。 材料和方法 一、 材料表面 1. 实验动物和动物 清洁级Sprague-Dawley大鼠20只,体质量200~230 g,雌雄各10只,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。动物饲养于25℃净化实验室内,混合饲料喂养,自由饮水。 2. 主要试剂和仪器 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS Sigma公司),SOD、MPO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),TLR2、TLR4、TLR9兔抗鼠多克隆抗体(Santa Cruz公司),免疫组化SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),TLR2、TLR4、TLR9引物(上海英骏生物技术有限公司),Trizol试剂(Gibco公司),M-MLV逆转录酶和Taq DNA聚合酶(Promega公司)。 二、 方法 1. 基肥模型的制作 20只大鼠随机分为模型组和正常对照组,每组10只。参照Hibi等报道的方法制备大鼠结肠炎模型。大鼠禁食24 h,戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉,将聚乙烯导管插入结肠内距肛门口7~8 cm处,以注射器注入100 mg/kg TNBS+等体积无水乙醇灌肠,倒置30 s,苏醒后正常饮食。正常对照组大鼠予等体积0.9%Na Cl溶液灌肠。 2. 结肠黏膜损伤指数cmdi的测定 造模后第2 d起每天观察和评价大鼠体质量、腹泻和肉眼血便情况,于第10 d计算疾病活动指数(DAI)以评估疾病活动度(见表1)。第10 d处死大鼠,取肛门至回盲部肠段,沿肠系膜缘纵行剖开,于体示显微镜(解剖镜)下观察结肠大体形态,参照王皓等采用的大体损伤评分标准计算结肠黏膜损伤指数(CMDI)。每只大鼠于远端结肠、横结肠和升结肠各取一块约2 mm×10 mm的组织标本,另在严重炎症或溃疡处至少取一块组织标本,常规石蜡包埋、切片、HE染色,由病理科医师参照王皓等采用的组织学损伤评分标准观察、评分,结果取各部位标本评分的均值。 3. 黄系mpo活性测定 按上文所述方法取结肠组织标本,以0.9%Na Cl溶液(SOD)或匀浆介质(MPO)手工匀浆,制成1%(SOD)和5%(MPO)匀浆。以黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,以紫外分光光度法测定MPO活性,具体步骤参照试剂盒说明书。结果取各部位标本测定值的均值。 4. 酶标链霉亲和素混合物pbs 采用SP法。各部位组织切片脱蜡、封闭、抗原热修复;滴加TLR2、TLR4和TLR9兔抗鼠多克隆一抗(稀释度均为1∶100);滴加二抗酶标链霉亲和素复合物;显色;复染;封片。每次检测均以0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。 采用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件(Media Cybernetics),以胞质和胞膜染成棕黄色为阳性细胞,每一样本随机选取5个高倍视野(×400),计数每平方毫米内阳性细胞数,以x±s表示。 5. 逆转录pcr检测总rna表达 分别取50~100 mg各部位结肠黏膜组织,捣碎,加入1 ml Trizol溶液,匀浆;加入200μl氯仿,剧烈振荡15 s,12 000×g离心15 min;取上清液0.5 ml,加入异丙醇0.5 ml,12 000×g离心10 min;弃上清液,加入750 ml/L乙醇洗沉淀,晾干。取4μl总RNA行逆转录,取2μl逆转录产物行PCR扩增。各引物序列、退火温度和产物大小见表2。15 g/L琼脂糖凝胶电泳,PCR产物以培清JS-300凝胶图像分析系统(上海培清科技有限公司)、Olympus DP Controller软件和Image-Pro Plus 5.1图像分析软件行光密度分析,目的基因m RNA的相对表达量以目的基因光密度值与内参照基因光密度值的比值表示。 三、 两组患者t检验和pearson相关分析 应用SPSS 13.0统计软件,计量资料以x±s表示,组间比较采用两独立样本t检验,各指标间相关性的分析采用Pearson相关分析,P0.05为差异有统计学意义。 结果 一、 新时导致“争议” 造模后1~2 h大鼠即出现肉眼血便,1 d后出现懒动、拱背、厌食、大便次数增多、软便或稀便,3 d时达高峰,以后逐渐好转。造模10 d后DAI较正常对照组显著升高(见表3)。 二、