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蛋白质组学技术在骨肉瘤增生分化中的应用 蛋白质组的概念最早于1994年意大利诺奇可通过的二维电泳会议提出。蛋白质组是指一个细胞、组织或体液在特定时期所包含的全部蛋白质成分。蛋白质组学是对这些蛋白质成分全面分析的学科。由于它的整体性研究特点,蛋白质组学研究不依靠任何假设,而是不断地产生新的假设。随着人类基因组计划的完成、后基因组时代的到来,人们意识到生命活动的最终形式是由蛋白质来完成的。蛋白质组的研究逐渐成为热点,其技术在肿瘤、泌尿系疾病、消化系疾病、呼吸系疾病、营养性疾病等中的应用,将为临床阐明各疾病发生机制、寻找新的诊断治疗方法带来希望。本文就蛋白质组学技术及其在骨科疾病中的应用研究进展作一综述。 1 研究的科学 蛋白质组学是通过生化、质谱等方法对细胞内全部蛋白质进行大规模研究的科学。临床蛋白质组学研究主要有两大技术路线,一个是应用组合蛋白质分离技术和质谱技术寻找疾病的生物学标记;另一个是利用已发现的生物学标记,经蛋白芯片技术达到诊断和治疗疾病的目的。 1.1 双向差异凝胶电泳2d-dige显示 最常用的蛋白质分离方法是双向电泳。首先根据蛋白质等电点采用等电聚焦分离蛋白,然后经聚丙烯酰胺电泳法,按分子质量进行双向电泳,分离后进行染色和蛋白点分析。通过软件定量分析实验组和对照组中蛋白点的不同密度。利用蛋白酶将感兴趣的蛋白点从凝胶上切下,以质谱和序列数据搜寻鉴定蛋白。 双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)显示技术是一种新的蛋白分析策略,可最小化凝胶上蛋白点对比问题,使得样本间蛋白点对比更加容易、更加准确。此技术应用Cy3和Cy5两种荧光染色,两种染料可一起结合到两个相比较的蛋白质样本上。标记的蛋白质样本混合在一起,然后在双向凝胶上溶解。Cy3和Cy5信号可单独分离,按每个点的标记率可定量分析样本间各自点的影像。尽管双向电泳是蛋白质组分析技术中的一个标准技术,但仍存在一些缺点,如有限的运动范围和分子大小范围,缺少与质谱技术在线相互作用,因此产生了许多液相多向分离技术。 1.2 肽指纹谱技术的分析方法 蛋白质鉴定的主要技术是质谱分析技术。质谱鉴定蛋白质有两种主要方法,即肽指纹谱技术和串联谱技术。肽指纹谱技术主要分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的均值,鉴定所有胰酶消化产物的分子质量,然后与已知蛋白质序列胰酶消化后的肽段大小相比较。肽指纹谱分析对主要病例的特异性不够。串联谱技术加液相色谱技术,可鉴定含有复杂成分的特殊蛋白质而不需预处理。 1.3 y2h技术 蛋白质相互作用分析技术主要有蛋白芯片技术和酵母双杂交技术。蛋白芯片可分成功能芯片、分析芯片和反相芯片三类。功能芯片可用于分析生物化学成分,例如酶底物的相互作用,或蛋白质的相互作用。分析芯片的蛋白质(抗原或抗体)固定于支持物上,由芯片探测样本,通过直接或间接标记与样本结合。分析芯片的用途之一是在健康和疾病体液蛋白质中寻找不同的蛋白质。反相芯片的细胞溶解物、血浆或标本固定于支持物表面,并由特殊检测物标记。 酵母双杂交(Y2H)技术利用真核转录因子中的DNA结合结构域(BD)和转录活化结构域(AD)相互接近而激活转录特性,由编码BD和AD的DNA片段与需要研究的蛋白质cDNA分别构建重组体。将两个重组体放在同一酵母细胞中表达,产生的融和蛋白质分别称为诱饵蛋白和猎物蛋白。如果蛋白质之间存在相互作用,则BD和AD被拉近,转录活性恢复,即可激活下游报告基因的表达。因此,应用Y2H技术可分析已知蛋白质之间是否存在相互作用,确定发生相互作用所必需的功能域;也可从已知蛋白质出发,探索与该蛋白质存在相互作用的未知蛋白质;还可利用Y2H技术基于核酸操作的特点,对基因组结构已知的生物,在只知编码蛋白基因而不了解具体蛋白质的情况下,实现蛋白质组范围内的相互作用分析。 蛋白质相互作用分析技术还有免疫共沉淀技术、DNA序列分析法、GST融合蛋白技术、噬菌体展示技术、荧光共振能量转移显微成像技术、原子力显微技术、Biacore表面等离子体共振技术和蛋白酶足迹法等。 1.4 数据库内容数据库 目前蛋白质组研究相关数据库有蛋白质氨基酸序列数据库、蛋白质结构域与家族数据库、蛋白质高级结构及分类数据库、蛋白质双向电泳(2-DE)图谱数据库、蛋白质相互作用数据库,以及各种类型的专一性蛋白质数据库。蛋白质组研究涉及的软件工具主要有蛋白质双向电泳图谱分析软件、蛋白质鉴定工具、蛋白质结构分析与功能预测工具等,这些工具的应用可对蛋白质相关结构、性质与功能的实验研究,起到一定的指导参考作用。 2 蛋白质组理论对骨科疾病的应用 2.1 蛋白质的获得 蛋白质组学技术有助于类风湿性关节炎和骨关节炎生物学标志的发展,扩展对此类疾病病因的理解,提高早期检测和治疗效果评价。de Ceuninck等应用蛋白质组学技术