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中药活性成分筛选的通量研究技术 目前，中国的创新药物研究水平仍然很低。临床药物长期依赖制备和进口，每年进口300亿元。目前国际上对新药研发竞争激烈,但同时新药研发困难重重,研发速度并未加快,技术难度不断提高,2010年仅有20个新化学结构药物获FDA批准上市,新药发现模式亟待改变。如何使我国摆脱药物依赖进口和仿制的困境是我国医药卫生领域的一个战略课题。研究表明具有数千年临床经验的中药是创新药物的宝库,如何从这一宝贵资源出发,在网络药理学和高通量技术支持下推动中药的现代化和国际化是一个亟待解决的重大问题,具有重大社会价值和经济价值。 中药现代化和物质基础研究是医药界的研究难题,复方和药材含有众多的活性成分,常规提取分离和活性筛选不仅速度慢、成本高,而且还存在活性成分易丢失,纯度与活性背离的难题。以上问题的解决关键在于三个方面,一是如何快速得到含有活性化合物的民族医药样品,二是如何高效研究其中活性成分,排除与主治无关或毒性成分,三是在网络药理学指导下研究各组分对多靶点的活性。 1 民族药分离的应用进展 高通量技术是解决中药活性成分研究难题的思路之一。所谓高通量技术包括高通量制备、高通量筛选、高通量基因芯片、高通量蛋白芯片等技术。现代制备色谱技术以快速、高效、高载样量和自动化为特点,融合了传统色谱的经典理论和现代科学技术中的众多创新之处,解决了许多传统色谱未能解决的问题。可用于少数民族传统医药样品的快速制备和分离。可用于高通量制备的色谱包括快速制备色谱(闪式柱色谱)、中压制备色谱、高压制备色谱、高速逆流色谱、超临界流体色谱等。 值得注意的是,提取过程应在传统医药的配伍理论、炮制工艺和使用方法的指导下进行,尽量保持所制备组分中的物质忠实于民族药物的原始面貌,除最常使用的水、乙醇等溶剂提取法,还可采用水蒸气蒸馏法提取挥发油、采用压榨法提取新鲜药材中含量较高的成分,以及近年发展起来的超临界流体萃取法、超声提取法、微波提取法等都可视具体情况加以应用,使药物中的各种成分得到尽可能全面的提取。研究者常遇到的难题是:在样品分离过程中,有毒溶剂的使用与残留是否将对下一步的筛选工作产生干扰,如何保证民族药物在分离过程中不发生变性,尤其是微量、不稳定、易挥发成分在分离中得以保留,这些关键技术问题需要在预实验中进行耐心考察。 闪式柱色谱(flash chromatography,FC)属于中低压液相色谱的一种,于20世纪70年代末开始应用于天然产物的分离纯化。在国外,快速硅胶柱色谱已成功应用于天然产物样品库的建立,并将样品库用于活性物质的高通量筛选。近年来,闪式柱色谱技术引入我国,但在实验室中的应用仅限于植物单体分离和一至几个目标化合物的纯化。由于其快速、便捷、制备量大、经济的特点,应用于快速划段分离,较之常压与高压液相色谱应具有自身的独特优势,因此,本实验室尝试将其应用于少数民族药大复方全组分的快速划段分离,在国内外均具有创新性,分离结果见图1。色谱条件:Venusil MP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相甲醇-水体系,甲醇中含0.5%乙酸,线性梯度条件0~35min,5%~70%B;35~40 min,70%~100%B;流速1 m L·min-1;检测波长280 nm;柱温30℃;进样量5μL;成分鉴定结果见图2。 通过闪式柱色谱技术,可以快速分离到数百个组分,每个组分包含一个单体或为多个单体的组合物,各组分的平均质量为200 mg,量少者亦在10 mg以上,达到细胞水平筛选和化学分析的用量要求,且该方法重复性高,该技术用于传统复方药物组分制备属于国内外首创,对于中药研究具有重要应用价值。 2 中药提升抗脑卒中作用的药物靶点 Andrew L Hopkins在2008年提出“网络药理学是创新药物研发的下一个范式”。网络药理学是系统生物学、系统药理学的发展,与我国中药的有效成分组/群、多层次多机制多靶点概念契合度较高,对中药的发展具有指导意义。以网络药理学为指导,研究疾病发生发展的基因组和蛋白质组,揭示疾病的病理病机,并以此为指导,提高开发创新药物的科学性和准确性。 网络药理学认为生命是一个复杂的过程和体系,疾病是由多个彼此之间存在着相互作用和动态变化的基因、蛋白引起的基本生理和病理现象。“组合药靶”是中药药靶的发现策略之一。即根据以往研究进展,从基因功能网络中寻找中药治疗疾病特异相关的基因组合,并观察验证中药对这些特异性基因组合的影响,提供中药的生物活性信息。一旦确证中药影响这些特异性分子组合就可以将这些基因以及由这些基因表达的蛋白作为该中药的“组合药靶”。通过研究验证并完善组合药靶策略有助于民族创新药物的出现和中药的现代化,且由于中药的活性可以为网络药理学提供实证,有助于丰富和发展网络药理学。 以脑卒中神经病变为例,