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sw和pp20培养基分离分离海洋蛭弧菌及其多样性分析 扁平昆虫生物（扁平昆虫）被称为b.l.还有一些家庭出生的小寄生虫。这些是以其他敏感的革兰氏阴性菌为材料的小型寄生虫。有一个独特的生活周期：在独立攻击阶段，扁平昆虫被识别、入侵并固定在主甲板菌的周质空间中。在周质中，扁平昆虫利用主甲板细胞的营养进行丝状生长，并通过复合分裂再次分裂。最后，解码主甲板，释放多个子代理弧菌细胞，开始新的生活周期。蛭弧菌的这种捕食特性, 使其在替代抗生素生物防治有害细菌上具有显著应用价值和前景。在水产养殖实践中, 目前已有一些研究表明蛭弧菌具有防治水产养殖细菌病害的潜力。分类上, 蛭弧菌包括在δ-变形细菌纲 (Deltaproteobacteria) 蛭弧菌目 (Bdellovibrionales) , 目前被分为两个科:蛭弧菌科 (Bdellovibrionaceae) 和噬菌弧菌科 (Bacteriovoracaceae)。其中海洋或嗜盐蛭弧菌迄今都归属于噬菌弧菌科, 普遍存在于各种咸水或高盐生境中, 在种的水平上至少可划分为8个类群和3个单一分离物。 蛭弧菌的分离培养和计数与噬菌体相似, 需要敏感宿主细菌, 故常用双层平板培养法, 上层培养基中加入宿主菌供其裂解以生长繁殖。分离计数海洋蛭弧菌的培养基通常需要海水配制, 目前主要使用含0.1%聚蛋白胨 (Polypeptone) 的双层琼脂培养基和不另加营养的双层琼脂培养基, 也有用其它培养基分离海洋蛭弧菌的报道。不同培养基对同一类微生物的分离培养效果可能会有很大差异。目前, 对上述两种报道较多的培养基分离和计数海洋蛭弧菌的效果还未见比较研究, 因此在分离和检测海洋蛭弧菌时选用何种培养基更有效率尚不明确。 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) , 目前是世界, 尤其是我国养殖面积和产量最高的虾种。对虾产业可持续发展的首要问题是苗种供应, 其市场需求量巨大。而对虾育苗系统相对封闭, 仔虾期前通常很少甚至不换水, 同时由于饵料、残骸和排泄物的积累, 育苗水质易于恶化, 细菌大量滋生, 极易诱导细菌性特别是弧菌病害暴发, 造成幼体尤其是溞状期幼体大量甚至全部死亡。因此如何有效预防弧菌病是对虾育苗中长期面临的突出问题。以往对海洋蛭弧菌的研究表明它们更易裂解与其分离自相同或相似环境的细菌, 特别是其中的弧菌。近年一些报道也都表明海洋蛭弧菌能有效消减或调控人工和自然养殖海水中弧菌含量, 鉴此, 从对虾苗池分离海洋蛭弧菌用于幼体弧菌病的防治可能更显成效。但迄今为止, 还鲜见有从水产动物育苗环境分离海洋蛭弧菌的报道, 对其多样性更是缺乏认识。 本文在研究两种常用培养基对海洋蛭弧菌计数效果基础上, 结合凡纳滨对虾苗池可培养海洋蛭弧菌多样性研究, 进一步比较两种培养基分离未知海洋蛭弧菌的效率, 为更有效分离和检测海洋蛭弧菌提供方法依据, 并为利用海洋蛭弧菌生物防治对虾育苗期弧菌病害提供依据和基础。 1 材料和方法 1.1 分离鉴定细菌 溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) zou A, 副溶血弧菌 (V.parahaemolyticus) zou B, 以下分别简称zou A和zou B, 是以往分离鉴定的对虾幼体病原菌, 用作本研究分离、培养和计数海洋蛭弧菌的宿主菌。噬菌弧菌 (Bacteriovorax) NA7和NF1是以往分离鉴定分别属于噬菌弧菌科类群Ⅳ和Ⅸ的海洋蛭弧菌, 简称NA7和NF1, 用于测试培养基对已知海洋蛭弧菌的检测效果。 盐单胞菌 (Halomonas sp.) ZJ2214, 拉布伦茨氏菌 (Labrenzia sp.) ZJ2801, 副球菌 (Paracoccus sp.) ZJ2215, 假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas sp.) ZJ6102, Thalassobius sp.ZJ2407和Phaeobacter sp.ZJ3003是本实验室从凡纳滨对虾正常育苗水体中分离鉴定的细菌;哈氏弧菌 (V.harveyi) LW1是本实验室从发病对虾育苗水体中分离鉴定的细菌, 它们与zou A、zou B一同作为宿主裂解范围测试用菌株。 1.2 细胞培养wn SWYE培养基, 用作本研究宿主菌的培养。 海水双层琼脂 (Sw) 培养基 (g/L):底层琼脂10, 上层琼脂5, 海水配制。上层宿主细胞参考Wen等方法制备。 聚蛋白胨20双层琼脂 (Pp20) 培养基 (g/L):聚蛋白胨1, 底层琼脂10, 上层琼脂5, 海水配制。上层宿主细胞参考Williams等方法制备。 1.3 复配时上层水样的采集 选择一个正常育苗的凡纳滨对虾苗池, 当幼体变态至溞状2–3期时, 采集中上层水样, 4°C运输和保存。采样时苗池水温、盐度和p H分别